PCR、载体构建及转化

PCR、载体构建及转化1.目的基因分离(PCR）2.载体构建3.转化1.目的基因分离(PCR）TherewasatimewhentoamplifyDNA,Youhadtogrowtonsandtonsoftinycells.ThenalongcameaguynamedDr.KaryMullis,Saidyoucanamplifyinvitrojustaswell.Justmixyourtemplatewithabufferandsomeprimers,Nucleotidesandpolymerases,too.Denaturing,annealing,andextending.Wellit’samazingwhatheatingandcoolingandheatingwilldo.PCR,whenyouneedtodetectmutations.PCR,whenyouneedtorecombine.PCR,whenyouneedtofindoutwhothedaddyis.PCR,whenyouneedtosolveacrime从前你要扩增DNA，总有培养大批细胞的重任要你背。这时有个家伙叫KaryMullis博士的，他钻出来说体外合成也一样OK！只要把你的模板混上缓冲液，再加些引物，还有核苷酸和聚合酶。变性，退火，和延伸。加热-冷却-加热太神奇了！当你想要检测突变，来啊做PCR吧！当你想要基因重组，来啊做PCR吧！当你想知道孩子他爹到底是谁，来啊做PCR吧！当你想要侦破大案，来啊做PCR吧！PCR之歌目的基因分离(PCR）PCR技术的原理温度（℃）时间（min）94726094℃变性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循环1循环2循环3PCR反应的温度循环周期PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。引物设计常用软件：DNAstar：序列分析Primer5.0：引物设计DNAman：序列比对在线引物设计：载体构建T-Vector连接反应体系：•2×LigationBuffer2.5µl•Insetfraction1.5µl•T-easyvector0.5µl•T4-ligase0.5µl混匀后置16℃连接0.5-小时。热击转化大肠杆菌大肠杆菌感受态制备细菌细胞在一定的生理状态（感受态），或经CaCl2处理，或制备成原生质体的情况下，都可吸收外源ＤＮＡ，利用这一特性可将重组ＤＮＡ导入受体细胞中，用质粒作载体的遗传工程一般使用这种方法。由于E.coli不会自发地产生感受态，因此E.coli的转化一般采用钙转化法。该方法是将E.coli用冷CaCl2(0℃)致敏，而后在高温（42℃）下热休克，这样可使外原DNA进入受体细胞。涂平板（带抗性ampr）（一）准备工作：1、制好的带选择压得平板，涂布器，ITPG，X-Gal器；枪头，塑料板，酒精灯、记号笔，封口膜等，2、提前打开37℃培养箱（二）步骤1、把相关用具放入超净台，开紫外灯，10min.2、将ITPG从-20℃取出溶化。3、到时间后，烧涂布器，4、从4℃取出平板，置台上。5、取40µlX-Gal于平板中央，6、取16µlITPG加入到40µlX-Gal上，涂匀上述液体，直到板面发涩为止。7、将热击产物100µl加于平板上，涂布均匀。8、涂好的板封口后标记好质粒种类、日期，制作人，倒置于37℃培养14小时。蓝白斑筛选：•野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。•设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株，无法作用于X-gal产生蓝色物质。•操作中，添加IPTG以激活lacz‘中的β-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色（空载）。•当外源DNA与含lacz‘的载体连接时，会插入进MCS，这种重组质粒不再表达α肽链，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。挑菌准备工作:1、提前打开37℃摇床，开紫外灯杀菌。2、灭菌的带盖的刻度试管，试管架，消毒的黄枪头，镊子，Amp抗性的LB液体培养基。步骤：1、将Amp抗性的LB液体培养基分装入试管，每管4-6ml。2、用黄色的枪头挑白色的单克隆，连带枪头放入试管中。3、盖上试管盖，置摇床中，37℃，170转摇培过夜（16-18小时）。质粒DNA提取•采用改良的SDS碱裂解法，结合生物膜选择性吸附DNA旋转离心柱技术快速纯化质粒DNA。质粒DNA提取准备：1、检查试剂是否齐全，够用，-20℃预冷的无水乙醇2、灭菌的小三角瓶、枪及枪头、计时器、塑料插板、记号笔、吸水纸、盛冰盒3、计算SII的用量（NaOH,SDS）步骤：1、在超净台内将试管中的菌液移入1.5ml离心管中，2、1000rpm离心1.0min,其间取SI，和RNaseA,3、弃上清，留沉淀4、每管加入100µlSI和RNaseA0.4µl（RNaseA浓度为10.0mg/ml）（可提前算好总的SI和RNaseA用量，混匀后分装于离心管中）5、充分涡旋均匀，6、计算好SII用量，临时将0.4NNaOH,2%SDS等体积混合于灭菌的三角瓶中，7、每管加入混合好的SII200µl，轻轻上下颠倒几次质粒DNA提取8、插入冰盒中，静置5min,此时菌液变的清亮粘稠9、每管加入SIII150µl，上下颠倒数次，此时有白色絮状沉淀出现。10、冰浴5min11、13000rpm5min12、吸上清液于新离心管（约420µl）13、加入2倍体积-20℃预冷的无水乙醇，上下颠倒，混匀，-20℃置30min以上。14、13000rpm5min，可见白色沉淀15、留沉淀，弃上清，加入70%乙醇900µl悬浮沉淀16、13000rpm5min17、弃上清，留沉淀，风干后呈透明无色。18、加入30µlMQW，溶解沉淀。酶切鉴定准备：•1、提前开37℃水浴，•2、检查药品、用具是否齐全•3、合理安排时间，一般晚上做，37℃水浴过夜。•4、盛冰盒。实验在冰上进行。步骤：•1、反应体系(20µl)•10×BufferH2.0µl•BSA0.2µl•ECORI0.5µl•MQW16.3µl•质粒DNA1.0µl目的：检测克隆片断大小的准确性酶切结果检测测序•取菌液若干个送生物公司测序•填写测序单GateWay载体构建:•通过去除冗长的亚克隆步骤节省时间•同时将您的基因转移到多个表达系统•任何系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达GateWay载体构建:完成构建Gateway表达克隆仅需两步：（1）创建入门克隆，通过PCR或传统的克隆方法将目的基因克隆进入门载体。（2）混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体以及GatewayLRClonase酶，构建表达克隆。GateWay载体构建:常用载体：入门载体（BP反应）Pdnor222.1表达载体（LR反应）PMDC32（超量表达）PMDC164（启动子分析）PH7G（RNAi）pEarleyGate（ABRCstockDB-686）（亚细胞定位）pEarleyGate101（ABRCstockDB3-683）（亚细胞定位）3.转化电击转化农杆菌•准备：感受态农杆菌；预冷的电击杯；LB液体培养基；细胞融合仪•PCR鉴定•侵染植物•PCR鉴定•侵染植物噢噢！