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制备的电转化的感受态细胞可以用于化学转化操作吗？举报删除此信息ljy525380(站内联系TA)一般来说，电转感受态制备时都要用水和10%甘油洗数遍，其目的是为了尽可能的去除其中的盐离子成分，电击时才可以使电压附加在细胞两极，从而形成电穿孔，而不是电子直接通过盐离子传递；而热激感受态则是通过Ca2+等离子和试剂的作用改变细胞膜两侧渗透压，造成低渗的环境，菌会变得膨胀，细胞膜变薄，从而热激时吸收附着在菌表面的DNA。所以我感觉电转感受态是不太可能用于热激的，这些都是我认为的，供你参考吧cicelyzh(站内联系TA)不能。两种感受态的原理不同，LS的正解。电转化感受态细胞的制备主要是脱盐。略GenePulserXcell™系统是用于转染每种细胞类型的模块化电穿孔系统。系统包括主单元、ShockPod™电击槽以及选择的附件模块：电容扩增器（CE模块）和脉冲控制器（PC模块）。功能和优点通用电穿孔—转染所有细胞类型（从原代细胞和干细胞到细菌和酵母菌）预设实验方案—包括最常见的哺乳动物和细菌细胞类型灵活性—预设实验方案、优化实验方案、手动操作和/或用户实验方案的程序选择实验方案库—一系列电穿孔实验方案，适用于包括原代细胞、永生细胞和细菌细胞在内的各种细胞类型数据管理—能够存储和调用前100次试验中使用的参数，有助于故障排除可重复性—使用PulseTrac™电路和电弧保护功能以确保可重复性和样品防护系统选项GenePulserXcell总电穿孔系统（货号165-2660）—用于转染真核细胞和原核细胞的完整电穿孔系统；包含CE模块和PC模块GenePulserXcell真核电穿孔系统（货号165-2661）—用于大多数真核细胞（包括哺乳动物细胞和植物原生质体）的电穿孔；包含CE模块GenePulserXcell微生物电穿孔系统（货号165-2662）—用于细菌和真菌的电穿孔，以及对小体积样本施加高压脉冲的其他应用；包含PC模块更多信息功能可修改的传送参数包括时间常数、施加的实际电压、脉冲间隔和脉冲时间，具体取决于选择的波型（指数波或方波）提供一系列用于手动操作、预设实验方案、用户实验方案和优化实验方案的相关程序与0.1cm、0.2cm和0.4cmGenePulser®/Micropulser™电穿孔比色皿兼容与任何电穿孔缓冲液都兼容，包括Bio-Rad的GenePulser电穿孔缓冲液电转化仪仪器型号：GenePulserII生产商：USABio-Rad工作原理：GenePulserⅡ电转化仪器可用于原核细胞、酵母和哺乳动物细胞的转化。仪器采用PulseTrac波形传送系统，能产生最精确的指数衰减的脉冲，可在电转化杯里获得最佳的细胞转化。电穿孔是一个物理过程，利用电脉冲瞬时穿透原核细胞或真核细胞的细胞膜，使得细胞能够吸收各种不同种类的生物分子。当用化学或其他物理方法转化某些类型的细胞效率不高或有毒性时，电转化则可能是一种有用的方法。GenePulserⅡ电穿孔仪由三个部分组成：GenePulserⅡ装置及两个附属设备PulseControllerPLUS和CapacitanceExtenderPLUS。GenePulserⅡ可与另两个附属设备中的任意一个一起使用：对于细菌和酵母细胞的电转化（高电压/低电容），使用PulseControllerPLUS；对于哺乳动物细胞和胚胎组织的电转化（低电压/高电容），则应使用CapacitanceExtenderPLUS。系统参数：输入电压220-240V，50-60HZ输入电流15A最大输出电压和电流2500V，125A（正常负荷）电弧时限定值1500A输出波形PulseTrac指数衰减，RC时间常数取决于所选的样品和电容器输出电压调节50-2500V范围（取决于电容器）内，低电压范围（50-500V）和高电压范围分别具有2V和10V的调节精度。工作环境温度0-35oC湿度0-95%，无冷凝简易操作指南：1：打开电源2：根据自己的情况设置参数：如电容c=25F,电压v=1.8kV(0.1cm电击杯)，R=2003:将电击杯两壁水檫干4：电转：所产生的时间常数一般为4.6—5.0ms5:立即加入培养液恢复培养注意：电击杯两壁水一定要檫干；所制备的感受态细胞一定要干净，否则电流过大重点：1．电转化感受态细胞的制备第一天：0.高温灭菌大的离心管（25-50ml）以备第二天用0.准备几瓶灭菌水（总量约1.5升）,保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用1.用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10mlLB液体培养基的50ml离心管中。（同时做培养基和枪头的空白对照）2.过夜，37℃，220rpm。[让菌复苏，进入对数期的早中期。此刻更简单制得感受态细胞。]3.第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000mlLB液体培养基中，37度，220rpm-250，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4-0.6时，停止培养。[削减到达所需量的繁衍世代数，以削减菌的变异。]4.以下步骤务必在超净工作台和冰上操作。在超净工作台中，将菌液分装于大的灭菌离心管（提前高压灭菌）中，在冰上预冷20-30分钟（至少15min，但是也有人说10min，时间不要太长，特别是夏天），4℃，4000rpm离心10分钟。[使细菌的成长中止，代谢减慢。由于这时现已没有培育基了，假如细菌仍有很高的代谢功率，则有很多细菌逝世。][冰浴是为了降低细胞代谢率，避免细胞很多逝世。]5.弃上清（将一切上清倒光，能够将离心管倒过来），离心杯中加入少量预冷灭菌ddH2O，轻吹，（建议不要用枪吹，用10ml移液管）使沉淀悬浮后，然后加水稀释至离心管的2/3体积，4℃，4000rpm离心10分钟。6.弃上清，加少量预冷灭菌灭菌水，轻吹，重悬菌体，然后加水稀释至离心管的2/3体积，4000rpm，4℃，离心10min。7.弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加预冷灭菌的10%甘油至离心管的2/3体积,4℃,4000rpm,离心10min，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）。重复两次。8.小心弃去上清液，每个离心杯中加入5ml10％的甘油（就是1000ml菌液:5ml10%甘油的比例，500ml菌液就加2-3ml10%甘油），使沉淀悬浮后，将菌液以150ul/管分装于1.5ml的离心管中，直接用于电转化或-80℃冰箱中保存。同时取100μl感受态加0.01ngpuc18直接电穿孔转化，检测转化效率。9.次日观察转化子生长情况，并记录。2．连接产物纯化1．将连接产物转移至一1.5mlEppendorf管中，加入下列试剂:10ulofddH2O2ulof3MNaAC（PH5.2）50ulof无水乙醇轻轻混匀，稍微离心并将其置于-20℃放置1小时以上；2.4℃，topSpeed离心30分钟；3.小心移去上清，避免接触到管底的沉淀物；4.加入500ul70％的乙醇，轻轻颠倒几次洗涤沉淀（注：不要离心混匀）；5.4℃，topSpeed离心5分钟；6.小心移去上清，将此Eppendorf管置空气中直至无乙醇气味；7.加入10ulddH2O重新溶解沉淀，4℃短期保存，-20℃长期保存备用；3.电转化1.从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻；将0.1CM的电极杯和1.5ml灭菌离心管一起置于冰上预冷2.取1-2μl纯化后的DNA（DNA不要太多，防止向感受态里多带进了离子）于100ul融化的感受态细胞中，用粗口吸头的枪轻柔混匀，越温柔越好,小心混匀混匀！，3.将上述混合物转移到预冷的电极杯中，轻轻敲击电极杯，使混合物均匀，无气泡，进入电极杯的底部，静置冰浴5-10min。（怕感受态细胞量不够，吸得很多，电转时效果反而不好。）4.打开电转仪，调至Manual，调节200Ω，25uF,电压为2.5KV，时间不低于3毫秒，应接近5毫秒。转化的电压一般选择1.8kv（转细胞或是大质粒可以选择2.5kv）。5.从冰中取出电极杯，用纸巾吸干表面水分，务必擦干电转杯外的水气。6.将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速加入预热的1mlSOC液体培养基，快速而轻柔地重悬细胞后，转移到1.5ml的离心管中。（越快越好）电击后立即在电转杯中加入培养基（室温），很关键哦！7．37℃，轻摇120rpm，复苏1小时。8.取20ul转化产物加160ulSOC涂板，放于37℃温室，过夜培养，次日查看转化结果。其余菌液加1：1的30％的甘油后混匀－80℃保存。注：每块加有Amp的平板上均匀涂有X-Gal80μl，SOC80μl，IPTG20μl。不懂！！！由于感受态细胞在电转化中受损伤较大，筛选转化子的平板所含抗生素浓度应低一些。1．利用氨苄青霉素抗性筛选转化子时，用转化细胞铺平板的密度要低（90mm平板上不得超过105个菌落），同时37℃培养不应超过20小时，具氨苄青霉素抗性的转化体可将β－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围的抗生素，从而导致对氨苄青霉素敏感的卫星菌落的出现。4.电击杯清洗流程1．用清水将电击杯稍冲一下。2．向电击杯中加入的75%酒精浸泡2hr。3．弃去酒精，再用蒸馏水冲洗2~3遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上。4．加入无水乙醇2ml于电击杯中，浸泡30分钟。5．弃去无水乙醇，于通风厨内挥干乙醇。（电转杯用酒精消毒后一定要让酒精挥发干净）6．将清洗好的电击杯放入-20℃冰箱内待用。注：1．不同样品使用的电击杯应分开；2．每周用1％酒精浸泡30分钟。电转杯清洁处理:一般先冲洗，洗净；然后浸泡在75%的乙醇中；使用前我们都是放在超净台上，开启紫外，边吹风晾干，边进行紫外照射。电转杯的新包装或重复使用可能对转化率有一定的影响。低温操作，擦干电转杯外的水气。