色谱法分类

第五章、色谱内容第一节、色谱法的起源第二节、色谱法分类第三节、色谱图谱第四节、色谱分析的基本理论第一节、色谱法的概念1.概念色谱法又称色层法、层析法，是用于多组分有机混合物的一种高效分离技术。2.特点选择性好、分离效能高、灵敏度高、分析速度快等优点。3.先进性已逐步实现仪器化、自动化、高速化，并从分离手段发展到分析手段，应用范围不断扩大，分离的对象早已不限于有色物质，但“色谱法”这一名称一直被沿用。4.范围色谱法与现代新检测技术和计算机技术相结合，已广泛食品质量与安全等的有关工作，如样品中农药残留量的测定、农副产品分析、食品质量检验、生物制品的分离制备等。一、色谱法的起源1906年俄国植物学家茨维特首创了这种分离技术把植物叶绿体色素的石油醚浸渍液倒入一根装有碳酸钙吸附剂的细直玻璃柱中，再加入纯石油醚，任其自由流下，原混合物开始被分离成不同颜色的谱带(色素的分离)，且以不同速度通过柱子，然后按谱带颜色对混合物进行鉴定分析。茨维特把这种分离结果称为色谱图，把这种分离方法命名为色谱法。色谱法的本质色谱法是基于混合物各组分在两相(固定相和流动相)之间的不均匀作用进行分离的一种方法。不均匀作用是先决条件，是各个组分对两相亲和力的不同和向两相不均匀分配的可能性。由于混合物中各组分对两相的亲和力有差异，它们穿过固定相的流动速度(或在固定相中的滞留时间)就有不同，从而得到分离。流动相为气体的色谱分析法称为气相色谱法(GC)；流动相为液体的色谱分析法称为液相色谱（LC）。分为吸附柱层析、离子交换层析、分配层析、凝胶层析第二节、色谱法分类一、吸附柱层析：1）.原理:被分离物与吸附剂表面分子的相互作用被吸附，由于不同化合物结构及性质上的差异，在吸附剂上的吸附性能是不同的，在柱色谱分离过程中，用一定的溶剂系统洗脱柱子时，由于溶剂(洗脱剂)与混合物里各组分争夺吸附剂的活性表面，解吸出来的组分与溶剂始终存在着对吸附剂的竞争吸附，不同的物质洗脱剂对它们的洗脱能力也是不同的。2）.特点:因此吸附与解吸始终贯穿整个柱色谱过程，吸附与解吸是吸附柱色谱法的理论基础。吸附过程无选择性，吸附与解吸附过程可逆，但吸附强弱和先后顺序都基本遵循“相似相吸附”的经验规律。3）.常用极性吸附剂:硅胶、氧化铝、聚酰胺。1、举例－聚酰胺吸附层析法1.1原理:属于氢键吸附，聚酰胺通过分子中的酰胺羰基与酚羟基，或酰胺键上游离胺基与羰基形成氢键缔合而产生吸附。吸附强弱则取决于各种化合物与之形成氢键缔合的能力。1.2规律：①形成氢键的基团数目越多，则吸附能力越强；②形成分子内氢键的化合物，吸附相应减弱。③分子中芳香化程度高，则吸附作用强；反之则减弱。1.3范围：聚酰胺吸附层析特别适合于酚类、黄酮类化合物的制备分离。2、吸附柱色谱的原理吸附柱色谱是将待分离混合物样品均匀地加在装有吸附剂的柱子中，用适当的溶剂冲洗，由于吸附剂对各组分吸附能力不同，各组分在柱中向下移动的速度不同，吸附力最弱的组分随溶剂首先流出，通过分段定量收集洗脱液而使各组分得到分离。柱色谱装置如图。二、离子交换色谱1.1原理:以离子交换树脂或表面涂有液体离子交换树脂的固体颗粒为固定相，装在柱中，以水或含水溶剂为流动相，使样品溶液流过交换柱，溶液中的中性分子及具有与离子交换树脂可交换基团相反电荷的离子通过柱子从柱底流出，而具有相同电荷的离子则与树脂上的交换基团进行离子交换并被吸附到柱上。1.2规律：由于不同离子与同一树脂交换能力不同，移动速度也不同，在柱上形成色谱带，另选一适当的洗脱剂(含有比吸附物质更活泼的离子)进行洗脱交换，可将吸附物质按先后顺序从柱上洗脱下来，即可实现不同组分物质的分离。1.3范围：主要用于分离氨基酸，生物碱，糖类化合物。三、分配色谱1.1原理:将两相溶剂中的一相涂覆在硅胶等载体上作为固定相，再用与固定相不相混溶的另一相溶剂作为流动相，物质可在两相溶剂相对做逆流移动过程中不断进行动态分配而得以分离。1.2分类:（1）正相层析：固定相采用强极性溶剂，如水、缓冲溶液等，流动相则用氯仿等弱极性溶剂，称之为正相(normalphase)层析；（2）反相层析：以弱极性成分如石蜡油为固定相，流动相则以水、乙腈、甲醇强极性溶剂，则两相可以颠倒，称之为反相(reversephase)层析，更适合于水溶性成分的分离。液—液分配柱层析的分离条件可以基于相应的正相及反相分配薄层层析结果加以选定。四、凝胶色谱1.1原理:也叫分子筛过滤，利用分子筛分离物质的一种方法。所用载体，如葡聚糖凝胶，是不溶于水，但可在水中膨胀的球形颗粒，具有三维空间的网状结构。当在水中充分膨胀后装入层析柱中。加入样品，用同一溶剂洗脱时，由于凝胶网孔半径的限制，大分子将不能渗入凝胶颗粒内部(即被排阻在凝胶颗粒外部)，所以在颗粒间隙移动，并随溶剂一起从柱底先流出，小分子因可自由渗入并扩散到凝胶颗粒内部，故通过层析柱时阻力增大、流速变缓，较晚流出。1.2分类:(1)葡聚糖凝胶(2)羟丙基葡聚糖凝胶(SephadexLH-20)。1.3过程:样品混合物中各个成分因分子大小各异，渗入至凝胶颗粒内部的程度也不尽相同，故在经历一段时间流动并达到动态平衡，即按分子由大到小次序先后流出并得到分离。第三节、色谱图谱一.色谱流出曲线：在色谱分析中，当样品注入色谱柱后，由于各组分与固定相的作用力不同，在随流动相移动的过程中，逐渐在柱中得到分离并随流动相依次流出色谱柱，先后到达检测器。经检测器把各组分的浓度信号转变成电信号，然后用记录仪或工作站软件将组分的信号记录下来，这种组分响应信号大小随时间变化所记录下来的曲线称为色谱流出曲线，也叫做色谱图。RT:0.00-42.26SM:7G0510152025303540Time(min)0102030405060708090100RelativeAbundance23.9327.9625.684.2029.989.6317.2220.3334.0912.0140.3337.185.62NL:7.27E7TICMS2002-475二.色谱的有关术语色谱图中曲线突起的部分称为色谱峰，由于响应信号的大小或强度与物质的量或物质的浓度成正比，色谱流出曲线实际上是物质的量或浓度—时间曲线。理想的色谱流出曲线应为对称的正态分布曲线：RT:0.00-42.26SM:7G0510152025303540Time(min)0102030405060708090100RelativeAbundance23.9327.9625.684.2029.989.6317.2220.3334.0912.0140.3337.185.62NL:7.27E7TICMS2002-4751.基线：在实验操作条件下，只有纯流动相经过检测器时记录下的信号—时间曲线称为基线，应该是一条直线，若是斜线就称为基线漂移，如果基线出现上下波动则称为噪声。保持基线平稳，是进行色谱分析的最基本要求。2.色谱峰：是进行色谱分析的主要区域，有峰高、区域宽度和峰面积三个参数。①峰高:是峰顶点与基线之间的垂直距离,以h表示,是色谱定量分析的依据之一。RT:0.00-42.26SM:7G0510152025303540Time(min)0102030405060708090100RelativeAbundance23.9327.9625.684.2029.989.6317.2220.3334.0912.0140.3337.185.62NL:7.27E7TICMS2002-475②区域宽度:a标准偏差:峰高h0.607倍处色谱峰宽度的一半，用“σ”表示。b半峰宽:w1/2是色谱峰高一半处对应的峰宽。c峰底宽w:色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距。一般来说，区域宽度是色谱峰的重要参数之一，它可以衡量柱效，反映色谱操作的动力学条件，在相同的色谱操作条件下获得色谱峰的区域宽度值越小，说明色谱柱的分离效能越好，柱效越高。③峰面积由色谱峰与基线之间所围成的面积称为峰面积，用“A”表示，是色谱定量分析的基本依据，对理想的对称峰，峰面积与峰高，半峰宽的关系为A=I.065hxW1/2。3.保留值(retentionvalue)是组分在色谱柱中滞留时间的数值，或在柱中滞留时间内所消耗的流动相体积。保留值主要取决于各组分在两相中的分配情况，当条件一定时，任何一种组分都有一个相应确定的保留值。所以，保留值可以作为定性分析的参数。RT:0.00-42.26SM:7G0510152025303540Time(min)0102030405060708090100RelativeAbundance23.9327.9625.684.2029.989.6317.2220.3334.0912.0140.3337.185.62NL:7.27E7TICMS2002-4753.保留值①死时间tM、死体积VM：不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱内的空隙体积,因这种物质其流动速度与流动相流速相近。②保留时间hR、保留体积VR：组分从进样到出现色谱峰顶点时所需的时间称为该组分在柱内的保留时间对应于保留时间所消耗的流动相体积称为保留体积VR.③调整保留时间：扣除死时间后的保留时间，称为调整保留时间。④相对保留值在相同操作条件下，某组分2的调整保留值与组分1的调整保留值之比，称为相对保留值，是一个无量纲量。一组分的色谱流出曲线对色谱分析十分重要，从色谱图上可以获得以下信息：①根据色谱峰的各种保留值，可以进行定性分析；②根据色谱峰的面积、峰高，可以进行定量分析；③根据色谱峰的保留值及其区域宽度，可以评价色谱柱的分离效能以及相邻两色谱峰的分离程度；④根据色谱峰两峰间的距离，可以评价固定相或流动相的选择是否得当；⑤根据色谱峰的个数，可以判断样品所含组分的最少个数。第四节、色谱分析的基本理论色谱分析首先是组分的分离，只有当各组分分离之后，才能进行定性和定量分析。两组分色谱峰间的距离与它们在两相中的分配平衡或分配系数有关，两组分分配系数相差越大，两色谱峰间的距离就越大。色谱峰的宽窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，与扩散和传质速率有关。相邻色谱峰有足够大的距离而没有足够高的柱效，区域宽度比较大，同样不能得到满意地分离。色谱分析的基本理论有两个：一个是以热力学平衡为基础的塔板理论；另一个是以动力学为基础的速率理论，两个理论相辅相成，较为满意地揭示了色谱分析中的有关问题和现象。1、分配平衡①分配系数K在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比，称为分配系数，用“K”表示，即K值与固定相和温度有关，K值小的组分，每次分配达平衡后在流动相中的浓度较大，因此能较早地流出色谱柱，K值大的组分后出柱。所以，分配系数不同是混合物中有关组分分离的基础。②分配比在一定温度、压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的质量之比，叫分配比，又称容量因子，用表示，即式中：ms、mm分别为组分在流动相和固定相中的质量β称为相比率，是柱型特点参数；K为分配系数。③保留比Rs与分配比的关系组分在柱内的平均线速率νL与相同条件下流动相在该柱内的平均线速率ν之比值称为保留比，用Rs表示即所以，保留比Rs由色谱图可直接计算。Rs也称为滞留因子，它反映了组分在流动相中的分配比例数。例如，某组分完全不被固定相滞留，即该组分100％分配在流动相中。2、塔板理论塔板理论最早由马丁(Martin)和辛格(Synge)提出。该理论把色谱柱比作精馏塔，柱内由许多想像的塔板组成,每个塔板的高度为H，称为理论塔板高度。每个塔板内分为流动相和固定相两个部分，流动相占据的板内空间称为板体积。当待测组分进入色谱柱后，就在两相间进行分配并达到平衡，经过许多次分配平衡后，组分得到彼此分离。塔板理论从热力学平衡的角度处理色谱分离过程，解释了为什么流出曲线呈高斯正态分布，论证了保留值与分配比的关系，引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标。该理论对色谱柱的分离过程做了如下假设：①所有组分开始都进入第零块塔板，组分的纵向扩散(塔板之间的扩散)可以忽略，流