液质联用仪基本介绍及其应用技术

质谱仪基本介绍及其应用技术一.概述二.质谱分析原理三.仪器结构四.液质联用技术五.质谱仪基本操作六.仪器维护及注意事项一.概述质谱法（massspectrometry，MS）利用离子化技术，将物质分子转化为离子(分子离子和碎片离子)，按其质荷比（m/z）的差异分离、排列成谱图，从而进行物质成分和结构分析的方法。质谱仪是一种测量带电粒子质合比的装置，利用带电粒子在电场和磁场中运动（偏转、漂移、震荡）行为进行分离与测量。在离子源中样品分子被电离和解离，得到分子离子和碎片离子，将分子离子和碎片离子引入到一个强的电场中，使之加速，加速电位通常用到6-8kV,此时所有带单位正电荷的离子获得的动能都一样，即eV=mv2/2但是，不同质荷比的离子具有不同的速度，利用离子的不同质荷比及其速度差异，质量分析器可将其分离，然后由检测器测量其强度。记录后获得一张以质荷比（m/z）为横坐标，以相对强度为纵坐标的质谱图。1.什么是质谱？2.质谱分析过程质谱分析过程可以分为四个基本环节：1.通过合适的进样装置将样品引入并进行气化;2.气化后的样品引入到离子源进行电离，即离子化过程;3.电离后的离子经过适当的加速后进入质量分析器，按不同的质荷比进行分离;4.经检测、记录，获得一张谱图.3、质谱法的特点和用途1.测定非常准确的分子量，确定分子式。2.分析速度快，灵敏度高(5pg)，所需的样品少。3.分析范围广（气体、液体、固体）。4.根据质谱裂解规律对质谱图中的碎片离子进行解析，可鉴定或验证有机化合物。5.应用GC-MS、HPLC-MS等技术，可定性、定量地对有机混合样品进行分析。样品导入系统离子源质量分析器真空泵离子检测器放大记录器按m/z大小不同进行分离质谱图二.质谱分析原理质谱仪原理图进样系统离子源质量分析器检测器1.气体扩散2.直接进样3.气相色谱4.液相色谱1.电子轰击2.化学电离3.场致电离4.激光1.单聚焦2.双聚焦3.飞行时间4.四极杆5.离子阱6.串列式多级三.仪器结构质谱仪一般由进样系统、离子源、分析器、检测器组成。还包括真空系统、电气系统和数据处理系统等辅助设备。1.真空系统质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须在高真空状态下工作，以减少本底的干扰，避免发生不必要的离子-分子反应,所以质谱反应属于单分子分解反应。利用这个特点，我们用液质联用的软电离方式可以得到化合物的准分子离子，从而得到分子量。由机械真空泵(前极低真空泵)，扩散泵或分子泵(高真空泵)组成真空机组，抽取离子源和分析器部分的真空。只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达接收器，真空度不够则灵敏度低。2.离子源电离室原理与结构图根据离子化方式的不同分类：EI:电子轰击电离—硬电离。CI:化学电离—核心是质子转移。FD:场解吸—目前基本被FAB取代。FAB:快原子轰击—适合难挥发、极性大的样品。ESI:电喷雾电离—属最软的电离方式，通常只产生分子离子峰。适宜热不稳定的极性分子，能分析小分子及大分子(如蛋白质分子多肽等)。APCI:大气压化学电离—适宜做弱极性小分子。APPI:大气压光喷雾电离—适宜做非极性分子。MALDI:基体辅助激光解吸电离。通常用于飞行时间质谱和FT-MS，特别适合蛋白质，多肽等大分子。其中ESI，APCI，APPI统称大气压电离(API)3.质量分析器质量分析器的分类：1.单聚焦质量分析器特点：具有质量色散作用2.双聚焦扇形磁场-电场串联仪器(sector).3.四极杆质谱仪(Q).特点：扫描速率快，结构简单，价格较低。4.飞行时间质谱仪(TOF).5.离子阱质谱仪（TRAP）6.傅里叶变换-离子回旋共振质谱仪(FT-ICRMS).7.串列式多级质谱仪(MS/MS)：四极+TOF（Q-TOF）、三重四极杆（QqQ）、TOF+TOF是质谱仪中将离子按质荷比分开的部分,离子通过分析器后,按不同质荷比(M/Z)分开,将相同的M/Z离子聚焦在一起,组成质谱。四极杆质量分析器的示意图四级杆质量分析器四极杆分析器由四根棒状电极组成，它们距离相等而且互相平行，这四个棒状电极形成一个四极电场。四极杆处于对角位置的两根杆被连接在一起，其中一对杆之间施加电压，同时在另外一对杆上施加大小相同、极性相反的直流电压和相位相反、振幅/频率相同的射频电压。Vdc为直流电压，Vrf为射频电压。直流电压与射频电压叠加在一起，且两对电极的极性不停进行快速切换，使得带电离子震荡通过四极杆。4.检测接收器接收离子束流的装置有：电子倍增器、光电倍增器、微通道板将接收来的电信号放大、处理并给出分析结果及控制质谱仪个部分工作。从几伏低压到几千伏高压。5.数据及供电系统质谱仪的主要性能指标1.分辨率resolutionpower即表示仪器分开两个相邻质量离子的能力，通常用R表示，实验室内的TSQQuantum分别率为0.7。2.质量范围massrange四极质谱：4000以内离子阱质谱：~6000飞行时间质谱：无上限3.质量测量精度离子质量测定的精度，一般对质量几百的离子，测量误差应0.003质量单位。四、液质联用技术高效液相液质联用(HPLC/MS)是指高效液相液相色谱与质谱串联的技术。HPLC-MS主要由HPLC仪、接口离子源(HPLC与MS之间的连接装置)、质量分析器、真空系统和计算机数据处理系统组成。混合样品通过液相色谱系统进样，由色谱柱分离，从色谱仪流出的被分离组分依次通过接口进入MS仪的离子源处并被离子化,然后离子被聚焦于质量分析器中，根据质荷比而分离，分离后的离子信号被转变为电信号，传送至计算机数据处理系统，根据MS峰的强度和位置对样品的成分和结构进行分析。目前常用的HPLC-MS联用仪具有两大分类系统，一种是从MS的离子源角度来划分,包括电喷雾离子(ESI)、大气压化学电离(APCI)和基质辅助激光解吸离子化(MALDI)等；另一种是从MS的质量分析器角度来划分，包括四级杆质谱仪(Q-MS)、离子阱质谱仪(IT-MS)、飞行时间质谱仪(TOF-MS)、傅立叶变换质谱仪(FT-MS)。o质谱分析仪(MS)P需要高真空条件P质量分析系统P最好使用挥发性缓冲液o液相(HPLC)v高效分离混合物v流动相挥发后产生大量气体v出口压力为大气压v无质量限制v可以使用缓冲盐溶液HPLCMSInterface(KeytoSuccess!)大气压电离源(API)目前最常用的接口类型：1.电喷雾(ESI)2.大气压化学电离(APCI)3.大气压光喷雾电离源（APPI）电喷雾(ESI)的电离过程：库仑爆炸（CoulombExplosions）RayleighLimitReached++++++++++-----++++++++++-----++++++--++++++--溶剂蒸发++带电液滴分析物离子溶剂离子束分析物离子溶剂离子束盐/离子对中性化和物1.电喷雾离子源技术NeutralMoleculesAnalyteIonsClustersSalts毛细管液相的入口雾化器加热N2雾化气入口碎片碰撞电压(CID)锥孔八极杆四极杆高能打拿极/电子倍增器+++++透镜+++++++++++++液质联用的电喷雾(ESI)接口蒸汽通过电晕针放电形成带电荷的反应剂离子溶剂在蒸发器中蒸发+含有气溶胶的分析物分析物离子+++++++++++++++++++++++电荷转移至分析物分子++++流动相分析物溶剂---------[溶剂+H]+[溶剂+H]++M---------溶剂+[M]+大气压化学电离源(APCI)的电离过程：2.大气压化学电离离子源技术毛细管碎片碰撞电压（CID）Coronaneedle++++++++++++锥孔透镜四极杆++++八极杆热氮气液质联用的大气压化学电离源(APCI)接口高能打拿极/电子倍增器•离子化方式不同•ESI–在溶液中进行离子化•APcI–在气相中进行离子化•分析样品类型不同•ESI–极性化合物和生物大分子•APcI–弱极性化合物、小分子化合物(相对于ESI方式而言)，并有一定的挥发性•要求的流动相流速不同•ESI-0.001to0.3mL/min•APcI-0.2to2mL/minESI和APCI的区别其他事项1.扫描模式的选择2.流动相的选择3.流量和色谱柱的选择4.辅助气体流量和温度的选择1.扫描模式的选择（1）正负离子模式:正离子模式：适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。负离子模式：适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。（2）全扫描方式（Q1扫描）可以得到准分子离子，从而判断出其分子量，用于鉴别是否有未知物，并确认一些判断不清的化合物。（3）母离子扫描母离子分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，尽管它们的母离子的质量可以不同，但在分裂过程中会生成共同的子离子。（4）选择离子扫描（SRM模式）（又叫子离子扫描）用于结构判断(得到二级谱图即碎片离子)和选择离子对作多种反应监测（SRM）。该模式对目标物质最为灵敏，干扰最低，一般用于定量分析。2.流动相的选择常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液，如甲酸铵、乙酸铵等，还可以加入易挥发酸碱如甲酸、乙酸和氨水等调节pH值。3.流量和色谱柱的选择不加热ESI的最佳流速是1—50ul／min，目前多用l—2.1mm微柱；TIS源最高允许lml／min，建议使用200—400ul／min；APCI的最佳流速～lml／min，常规的直径4.6mm柱最合适。为了提高分析效率，常采用＜100mm的短柱。4.辅助气体流量和温度的选择操作中温度一般选择高于分析物的沸点20℃左右即可。对热不稳定性化合物，要选用更低的温度以避免显著的分解。五、质谱仪基本操作开机步骤以安捷伦6400系列质谱仪为例：•1.分别打开计算机、网络交换机（LANSwitch）电源、液相电源•2.打开质谱前面左下角的电源开关，等待大约两分钟，听到第二声溶剂阀切换的声音(表明质谱自检完成)后，可以联机。•3.质谱一接通电源，前级真空规就开始工作，监视前级真空值。•4.在计算机桌面上双击MassHunter采集软件图标，进入MassHunter工作站。•5.确认氮气气源输出已经打开，气体输出压力为90psi。•6.等待四极杆温度达到100℃，高真空达到4x10-5Torr之后，即可进行调谐或开始实验。关机步骤•1.在MassHunter采集软件内点击三级四极杆MS的图标，选择Vent执行放空操作。•2.可以在三重四极杆Method的Diagnosis界面观察涡轮泵转速的下降情况。•3.等待真空泵停转且内部真空放空后，系统会给出放空完成的提示，关闭MassHunter软件，然后关闭质谱及LC各模块、PC的电源.数据采集软件功能区、状态区介绍：方法建立打开MassHunter采集软件界面点击MethodEditor，如下图。或通过菜单FileNewMethod创建一个新的方法。定性分析打开定性分析软件，主要功能区常用快捷键介绍如下：六、仪器维护及注意事项1.每天实验完成之后，使用1:1异丙醇-水溶液清洗或擦洗离子源，注意勿将溶液喷入毛细管入口。2.每周开启前级泵上的气振阀两次，每次半小时。开启时可以将气振阀开到最大后，向回转半圈。3.每天清洗雾化器组件，在清洗前应留出足够的时间让它冷却下来，防止烫伤。4.氮气发生器过滤装置必须定期更换，应每半年到一年更换干燥气的气体净化管。MS维护周期表注意事项1.因为任何原因造成的断电，请关闭仪器面板左下角的开关，等待供电恢复10分钟以上再开启电源，否则有可能烧毁电路板。2.在仪器开机（即使处于休眠）时如果长时间停止气体供应，会造成真空腔体内部污染。3.在仪器开始抽真空时，请不要打开前级泵上的气振阀，否则可能因为回油污染真空腔体内部。4.会产生离子化抑制的溶剂要慎用，如三氟乙酸、有机胺类。禁用的溶剂有：强酸强碱、不挥发性酸及相应的盐（如磷酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐等）、表面活性剂、离子对试剂。5.质