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流式配色分析及实验设计1pefitc荧光素是具有荧光特性的染料只在特定波长激光照射后才发出自身荧光发出的荧光颜色（波长）也是固定的什么是荧光素关于流式抗体2流式细胞技术：在细胞分子水平上；通过单克隆抗体；对单个细胞或其他生物粒子；进行多参数；快速的；定量分析。3光学系统：经荧光染色的细胞在激光的照射下产生散射光和荧光信号，同时被前向光电二极管和一组光电倍增管（PMT）接收，荧光信号经一系列双色性反射镜和带通或长通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号光源液流通路信号和数据光源液流通路液流系统：鞘液包绕着单行排列的细胞依次高速通过流动池，而激光聚焦于流动池中心的样本流上，随后经检测的样本和鞘液流向废液桶。4前向角散射光信号5侧向角散射光信号6外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）7荧光信号•使用不同荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析•荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量8光学系统：滤光片•如何将一束混合的荧光区分开来，分别进行收集呢？•滤光片置于荧光探测器前，限定其接收的荧光的波长范围Longpass(LP)Shortpass(SP)Bandpass(BP)460500540460500540460500540SP500LP500BP500/509101112流式结果除了染色的每个荧光抗体的表达情况，还包含了细胞的大小和复杂程度的情况FSC：前向角散射光，值越大，细胞越大SSC：侧向角散射光，值越大，细胞越复杂13双参数散点图单参数直方图1415多色组合原则1.强弱搭配2.避免补偿3.减少偶联染料4.避开自发荧光16流式细胞术中常见的荧光抗体一览荧光素激发波长发射波长发射光颜色BV421(V450)405450蓝BV510(V500)500绿BV605605红Fitc(AF488,BB515)488(561）530绿Pe(PI)578橙Percpcy5.5695红Pe-cy7780远红Apc(AF647,ef660)635(640)660红Apc-cy7(Apc-H7,ef780)780远红17荧光素颜色calibur/C6Verse，CantoII，AriaFortesa，新CantoFC500CytoflexBV421(V450)蓝可选可选可选BV510(V500)绿可选可选可选BV605红可选可选Fitc(AF488,BB515)绿11111Pe(PI)橙22222Percpcy5.5红33333Pe-cy7远红444可选Apc(AF647,ef660)红45534Apc-cy7(Apc-H7,ef780)远红664可选常见流式仪可用荧光抗体一览18荧光素颜色Verse，CantoII，AriaBV421(V450)蓝7BV510(V500)绿8BV605红Fitc(AF488,BB515)绿1Pe(PI)橙2Percpcy5.5红3Pe-cy7远红4Apc(AF647,ef660)红5Apc-cy7(Apc-H7,ef780)远红6可以也仅可以最多选择8个荧光抗体去标记抗原；需要注意：同一通道不可以选2种荧光抗体，例如：AF488，BB515,FITC不可以同时使用；19CD5CD8染料的亮度与抗原表达强度相匹配20三大类:Primary:很好鉴定，容易区分阴阳性细胞群，阴阳性峰分得很开Examples:CD3,CD4,CD45Secondary:很好鉴定，较高水平表达，经常连续性表达Examples:CD27,CD28,CD45RA,CD45ROTertiary:低水平表达，激活性marker，或者表达区分不明显Example:CD25CD4CD45RACD25染料的亮度与抗原表达强度相匹配21染料的亮度与抗原表达强度相匹配强弱搭配：即弱表达的抗原搭配强荧光，强表达的抗原搭配弱荧光荧光素的强弱：强4：APC,PE,PE-CY7BV421弱4：Fitcpercpcy5.5apc-cy7BV510抗原的强弱：强的：CD3,CD4,CD8,CD45等弱的：大部分胞内/核内因子（IL系列，Foxp3等）；CD25,大部分CD大于100（CD127,CD133等）；22染料的亮度与抗原表达强度相匹配23染料的亮度与抗原表达强度相匹配Panel124染料的亮度与抗原表达强度相匹配Panel225染料的亮度与抗原表达强度相匹配Panel126染料的亮度与抗原表达强度相匹配Panel227避免补偿CD45-FITCDimCD4-PECD45FITC漏到PE，CD4PE弱信号分不开CD45-PerCPDimCD4-PECD45PerCP不漏到PE，弱CD4可以分开UncompensatedCompensateddataspreadduetospillover28避免补偿1）采用多激光激发减少重叠2）避免双激发荧光染料488激发：fitcpepercpcy5.5pe-cy7635激发：apcapc-cy7405激发：BV421BV510CD3/CD4/CD8可选fitcapc-cy7BV510减少Pe-cy5，Amcyan等荧光抗体的使用率；290hours2hours22.5hoursPECD8CD3PE-Cy5PE-Cy7样本曝光时间PerCP减少偶联染料的使用率：30选择更稳定的偶联染料：31自发荧光多的选择用635激发的染料BDHorizonTMV500CD45BDTMAPC-H7CD14FITCCD8PerCP-CyTM5.5CD4BDHorizonTMV450CD3APCCD19PE-Cy™7CD56PECD80FluorochromeAntigenPerfect!32多色组合原则1、要用什么抗体？要用多少种抗体？最多8种4+2+22、强弱搭配染料的亮度与抗原表达相匹配3、避免补偿不同激光器激发/避免双激发染料4、减少偶联染料使用更稳定的偶联染料5、自发荧光高的样本：红激光激发33优宁维流式免费课堂流式实验上机前的准备34CD19CD4CD56CD14CD16CD8CD(ClusterofDifferentiation)marker:用于鉴定白细胞的分类，不同的白细胞表面带有不同的CDmarker35通过带有荧光标记的抗体和抗原特异性结合：CD19CD4CD56CD14CD16CD836流式鉴定白细胞的各种亚型：37表面蛋白流式检测步骤：StainAnalyzeWash*238检测胞内细胞因子:39胞内因子流式检测步骤：FixPermeabilizeStainAnalyze40表面染色和胞内染色的区别？CD4IFN-rTh1细胞CD4IFN-r正常染色情况下，由于抗体无法穿过完整的细胞膜，胞内因子无法被染上颜色，仅表面marker染色成功；41通过固定破膜建立胞内染色通道IFN-rTh1细胞表面染色固定破膜胞内染色42固定剂和破膜剂固定剂：起稳定细胞膜、保持细胞膜表面抗体与抗原结合的作用；破膜剂：使流动的、完整的细胞膜产生小孔以利于抗体进入细胞；（少量沉淀正常，皂角苷沉降）破膜的位置不同，破膜剂的选择不同：对于核内/转录因子的检测，我们需要采用针对破核的破膜剂；43固定剂和破膜剂Thiskitenablesthefixationandpermeabilizationofcellswhichisnecessaryforstainingintracellularcytokineswithfluorochrome-conjugatedanti-cytokineantibodies.TheBDPharmingen™TranscriptionFactorBufferSetisoptimizedforfixingandpermeabilizingcellspriortoimmunofluorescentstainingandflowcytometricanalysisofcellsthatexpressspecificintracytoplasmicandintranuclearproteins.44胞内因子和核内因子的同时检测：问：同时检测Th1/Th2/Th17和Treg这几个细胞时是否有推荐的buffer？答：核内因子和胞内因子共测时一般推荐使用BD:562574转录/核内因子固定破膜试剂盒；但是：经验证，FoxP3与IL-4无法同时检测，但FoxP3和IL-17a、IFN-γ一起染色良好。故当需要同时检测th2/Treg时需要准备2种固定破膜试剂盒并分开检测。45胞内因子的含量与检测效果为何同时检测Treg和Th，Th的阳性率很低而Treg正常？46胞内因子的含量与检测效果为何同时检测Treg和Th，Th的阳性率很低而Treg正常？仅活化状态下的T细胞才会特异性的分泌相关分泌型细胞因子，而正常情况下大部分T细胞处于未活化状态；Foxp3本身属于转录因子，始终存在于Treg细胞之中；如想要鉴定到th中的细胞因子，则必须对其进行“开源”与“节流”。47胞内因子的含量与检测效果如想要鉴定到th中的细胞因子，则必须对其进行“开源”与“节流”。开源：刺激活化T细胞。方法有二：1:PMA（PHA/LPS...)＋Ionomycin:PMA能自由透过细胞膜，因此能绕过细胞膜受体直接激活PKC;Ionomycin则能使细胞膜外Ca2+进入膜内增加，导致细胞内游离钙浓度升高；只有PMA+Ionomycin联合应用才是使T细胞进入细胞周期的最有效的方法.2.CD3/CD28：通过包被CD3和添加游离的CD28来封闭抗原提呈，从而一定程度上可以促进T细胞增殖；但是效果不如PMA+离子霉素，并且对于某些T细胞亚型的活化效果也不好；48胞内因子的含量与检测效果如想要鉴定到th中的细胞因子，则必须对其进行“开源”与“节流”。节流：阻断细胞内的蛋白转运：1:Monensin：莫能霉素是一种离子载体(ionophore)，可以破坏高尔基体，抑制细胞内的蛋白转运；2.BFA:全称BrefeldinA（布雷霉素），是一种常用的蛋白转运抑制剂，特异性地可逆地阻断蛋白质从内质网(ER)转运到高尔基体(Golgi)49胞内因子的含量与检测效果TheLeukocyteActivationCocktail,withBDGolgiPlug™isaready-to-usepolyclonalcellactivationmixturecontainingthephorbolester,PMA(Phorbol12-Myristate13-Acetate),acalciumionophore(Ionomycin)andtheproteintransportinhibitorBDGolgiPlug™(BrefeldinA).50胞内因子的含量与检测效果经过“开源”和“节流”之后的样本和先前的实验结果对比：未刺激活化刺激活化后51流式实验上机模版设置和结果分析52流式实验上机模版设置设置上机模版需要用到：空白对照管：去除自发荧光同型对照管：去除非特异性荧光单阳补偿管：去除荧光泄漏实验样本管：检测样本53一、空白对照管：即只有样本的对照管；用来排除细胞的自发荧光，调节阈值、电压，设定阴性区域；54同型对照（IsotypeControl）：使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。二、同型对照管：即样本+同型对照抗体孵育的实验管；用来排除细胞和抗体FC段非特异性结合产生的荧光55非特异荧光产生原因分两类，一类是抗体Fc段与细胞表面的Fc受体非特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光，可使用FCR阻断剂阻断；另细胞损伤也会导致非特异性染色，此类染色无法阻断，需用同型对照对比或进行死细胞排除。例如：针对红细胞的抗体56当使用FCr阻断剂进行阻断后同型对照依旧有较强杂信号和非特性干扰时，可用PI,7-aad,FVS等染料进行死活细胞染色排除干扰；57选择BDFixableViabilityStainReagents（FVS染料）：FVS染色不会被固定，破膜以及洗