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福建中医药大学药学院本科毕业研究课题开题报告课题名称：连花解毒颗粒急性毒性及解热实验研究班级：07药学学生姓名：林波波导师所在单位：南京军区福州总医院药学科研究方向：药理实验研究导师姓名：周欣陈旭职称/职务：主管药师药师课题研究起止时间：2011年1月5日至2011年5月11日填表时间：2011年1月23日1说明一、本计划由学生本人在向导师小组作过开题报告后填写，一式一份，最后经系（院）及实习单位批准后，留系部存档。二、开题报告一般要求在课题研究前完成。三、计划批准后不得随意更改。四、在课题执行过程中导师检查两次。检查情况及变动情况应记录在表内。2一课题研究的目的与意义、国内外研究的发展概况和趋势1课题研究的目的与意义连花解毒颗粒由金银花、牛蒡子、芦根等多味中药提取制成，该处方是我院中医科专家长期在临床使用的验方，具有清热解毒，凉血利咽，宣肺化痰，止咳平喘的功效。临床适用于风热感冒，温病初起，流感、上呼吸道感染、咽炎、支气管炎、腮腺炎、斑疹等病症治疗[1－5]。中医理论认为：由于风热之邪犯表，则热郁肌肤腠理，卫表失和，故见身热较著，微恶风，汗泄不畅等症；风热上扰则头胀痛；风热之邪上犯则咽燥或咽喉红肿疼痛，口渴欲饮、鼻塞、流黄浊涕。中医的“毒”含义甚广，清热解毒中药所解之的“毒”为火热壅盛所致的“热毒”及“火毒”，主要用于温热病及热毒炽盛症。随着现代医学的不断发展，清热解毒中药所解之“毒”不仅包括“外源性之毒”(细菌、病毒、内毒素)，还包括氧自由基和细胞因子过度释放等“内源性之毒”[6]。连花解毒颗粒所含主药均为清热解毒中药的典型代表，利用动物发热模型对发热过程进行模拟，从而对解热作用进行进一步研究。本课题还对药物的急性毒性进行了考察，为临床安全用药提供了实验数据和理论基础。2国内外研究的发展概况和趋势目前，国内外研究药物急性毒性的方法有很多，经典的有半数致死量试验（50%lethaldose，LD50）、最大给药量试验等，除此之外，还有限量试验、近似致死剂量实验、扩展试验、固定计量法、剂量累积试验等。中药新药中应用最多的是半数致死量和最大给药量试验。《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》规定未在国内上市的由中药、天然药物组成的非注射给药的复方制剂，如该复方制剂处方组成符合中医药理论，有一定的临床应用经验，一般情况下，可采用一种动物，按临床给药途径进行急性毒性反应的观察。本课题选用啮齿类动物小鼠为实验动物，采用口服给药方式，对连花解毒颗粒进行急性毒性反应的研究。发热是清热药最主要的适应症之一，解热作用是清热药的一个重要共性。在实验中可以采用多种方法来引起实验动物发热，如细菌或细菌产物、造成无菌炎症、化学药物、刺激丘脑体温调节中枢及暴露于高热坏境等，这些发热模型均可用于解热实验研究，如目前国内外常用的有注射腐败枯草浸液、角叉菜胶、牛乳或蛋白胨、加热杀死的革兰阴性菌（大肠杆菌、伤寒或副伤寒杆菌、痢疾杆菌）菌液、伤寒副伤寒菌苗、啤酒酵母、2,4—二硝基苯酚等发3热方法研究中药的解热作用。为了进行机制分析或特殊研究目的，还可选用内生致热原生成及发热试验、微量PGE脑室内或下丘脑注射致热试验、LipidA、IL-1、干扰素及TNF性发热试验等[7]。本课题选用啮齿类动物大鼠为实验动物，拟采用角叉菜胶为发热模型致热源，皮下注射可于局部产生强烈的炎症反应，此炎症的形成主要与其诱导前列腺素生物合成及释放有关，可引起一个持续炎症反应，并激活巨噬细胞引发发热。因其来源不同，其致热作用有些差异，故于正式实验前宜先做预试验，以选择适宜的种类、浓度与剂量，此外在预实验阶段观察大鼠体温变化全过程。二主要研究内容本课题采用啮齿类动物大鼠和小鼠以口服给药方式，对连花解毒颗粒进行以下两个方面进行研究：（一）连花解毒颗粒急性毒性反应的研究（二）连花解毒颗解热药效学的研究三主要研究方案1连花解毒颗粒的急性毒性实验中药新药审评的技术要求规定，当受试药物的毒性很低，或者因浓度或体积的限制，无法测出LD50时，可仅提供最大给药量试验的结果,测定其能达到人用量的多少倍，对药物安全性进行评估，以耐受人用量口服100倍以上为安全[8]。1.1溶液的配制与预实验1.1.1溶液的配制连花解毒颗粒供试品1的制备：取连花解毒颗粒125.0g溶于100mL水中，搅拌均匀即得混悬药液，此作为连花解毒颗粒供试品1溶液（相当于人临床用量100倍）。连花解毒颗粒供试品2的制备：取连花解毒颗粒188.0g溶于100mL水中，搅拌均匀即得混悬药液，此作为连花解毒颗粒供试品2溶液。1.1.2预实验方法：1.1.2.1选择体重约20g的健康小鼠10只，雌雄各半，实验前禁食不禁水12h。每只小鼠按100g/kg/d量于12h内给予灌胃供试品1溶液2次，灌胃体积为0.4mL/10g，给药后连续观察7天。如果小鼠全部存活，则采用最大给药量法进行实验，如果小鼠部分或全部死亡则采用LD50的测定。1.1.2.2选择体重约20g的健康小鼠10只，雌雄各半，实验前禁食不禁水12h。每只小鼠按4150g/kg/d量于12h内给予灌胃供试品2溶液2次，灌胃体积为0.4mL/10g，给药后连续观察7天。1.2最大给药量法进行实验选择体重约20g的健康小鼠48只，雌雄各半，分成两组，每组24只，实验前禁食不禁水12h。实验组每只小鼠按150g/kg/d量于12h内给予灌胃连花解毒颗粒供试品2溶液2次，灌胃体积为0.4mL/10g。对照组每只小鼠给以生理盐水，一天两次，灌胃体积为0.4mL/10g。两组小鼠给药后连续观察14天。期间若有死亡小鼠即刻尸解，肉眼观察小鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾等)的变化，若肉眼可见异常则进行病理检查。若无14天后处死全部存活小鼠，解剖和尸检内脏器官有无异常。并记录14天内雌雄小鼠的行为活动、被毛、皮肤、呼吸、大小便、食欲，鼻、眼、口腔有无异常分泌物等情况（见附录Ⅰ）。根据公式计算出其能达到人用量的多少倍[9~11]，计算公式如下：每只的小鼠耐受药量成人平均体重(60000g)小鼠的最大耐受倍数（倍）小鼠平均体重（20g）成人每日用量2连花解毒颗粒对角叉菜胶所致大鼠发热的解热作用[13－15]52.1人与大鼠之间给药量的换算表2-1不同实验动物与人的等效剂量比值（注：剂量按mg/kg算，人按照60kg算）[12]动物小鼠大鼠豚鼠兔猫猴狗剂量比值8.655.985.153.112.590.9981.78通过查表可知大鼠与人的等效剂量比约为6倍实验动物用剂量＝（动物体重／人的体重）×人的剂量×6=(0.2kg/60kg)×60g×6=1.2g2.2致热因子溶液的配制与发热模型的建立2.2.1致热因子的制备：精密称取角叉菜胶（卡拉胶）100mg置于试管中，加入灭菌生理盐水（或蒸馏水）10mL，轻轻搅拌或摇匀，放置于4℃冰箱中过夜，次日晨取出，轻轻倒置数次直至混悬液均匀。2.2.2发热模型的建立：取12只健康大鼠，雌雄各半，于实验前8～10h禁食，但不禁水。实验前三天，每日测大鼠肛温2次，实验当日每小时测肛温1次，连续3次，选取体温变化不高于0.3℃的大鼠进行实验，取被选中的大鼠肛温平均值为基础体温。于大鼠两爪脚跖皮下各注射1%角叉菜胶悬液0.1mL/爪，分别于1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h测大鼠肛温，观察大鼠建模情况，如注射致热因子4小时后，大鼠体温开始升高，至6~7小时达高峰，并持续时间长于10小时，则可判断为建模成功，视情况调整致热因子的种类和剂量。2.3预实验观察：选取20只健康大鼠，雌雄各半，于实验前8～10h禁食，但不禁水。实验前三天，每日用体温计测大鼠肛温2次，实验当日每小时测肛温1次，连续3次，选取肛温变化不高于0.3℃的大鼠进行实验，取被选中大鼠肛温的平均值为基础体温。以角叉菜胶作为致热因子，参考相关文献，在预实验中设置两种实验方法：①大鼠每天给浓度为0.4g/mL连花解度颗粒3mL一次，连续3d。末次给药后，用体温计测量致热前肛温，然后于大鼠两爪脚跖皮下各注射1%角叉菜胶悬液0.1mL/爪，此后分别于1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h测大鼠肛温。②于大鼠两爪脚跖皮下各注射1%角叉菜胶悬液0.1mL/爪，此后立即给予每只大鼠浓度为0.4g/mL连花解度颗粒3mL，分别于1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h测大鼠肛温。观察动物反应情况和体温变化，选择最佳的实验方法（给药量计算：连花解毒颗粒60kg人每天用量为60g，按体表面积折算0.2kg大鼠正常用量为1.2g，0.2kg大鼠每次灌胃3mL，即连花解毒颗粒配制的浓度为1.2g/3mL=0.4g/mL）。62.4连花解度颗粒解热效果正式实验：根据预实验结果，选取实验方案。大鼠于实验前8～10h禁食，但不禁水。每日用体温计测大鼠肛温2次，连续3日，实验当日每小时测体温1次，连续3次，选取体温变化不高于0.3℃的健康大鼠，取被选中大鼠体温的平均值为基础体温。将大鼠随机分成七组，灌服以下七种药物：①连花解毒颗粒低剂量组：0.2g/mL连花解度颗粒3mL②连花解毒颗粒中剂量组：0.4g/mL连花解度颗粒3mL③连花解毒颗粒高剂量组：0.8g/mL连花解度颗粒3mL④双黄连颗粒阳性对照品组：0.2g/mL柴黄颗粒3mL⑤阿司匹林阳性对照品组：6.7mg/mL阿司匹林3mL⑥空白辅料对照组：266.7mg/mL空白辅料3mL⑦模型组：不给药根据预实验确定的试验方法建模，于1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h测大鼠肛温。记录每只大鼠的体温变化并绘制曲线图，利用SPSS软件分析计算，判断连花解毒颗粒组与模型组体温差别是否有统计学意义(P0．05)，即连花解毒颗粒的解热效果（给药量计算：①连花解毒颗粒60kg人每天用量为60g，按体表面积折算0.2kg大鼠正常用量为1.2g，0.2kg大鼠每次灌胃3mL，因此配制的连花解毒颗粒中剂量组浓度为1.2g/3mL=0.4g/mL；②双黄连颗粒60kg人每天用量为30g，则大鼠正常用量为0.6g，因此配制的双黄连颗粒的浓度为0.6g/3mL=0.2g/mL；③通过查阅文献，解热实验大鼠阿司匹林对照组用量为20mg/d，因此配制阿司匹林浓度为20mg/3mL=6.7mg/mL；④连花解毒颗粒人每天用量为40g，0.2kg大鼠正常用量为0.8g，0.2kg大鼠每次可灌胃3mL，0.8g/3mL=266.7mg/mL）。7附录Ⅰ急性毒性试验的一般观察结果与可能设计的组织、器官、系统89参考文献：[1]何晶．金银花的药理作用及临床应用[J].天津药学,2008,20（5）,74-76.[2]倪华，施霞，刘云海．板蓝根化学成分及其药理活性研究进展[J].齐齐哈尔医学院学报，2008，29（13），1609-1610.[3]国家药典委员会，中华人民共和国药典第一部[M].北京，化学工业出版社，2010，20.[4]简永耀，靳龙文．连翘的化学成分及药理学研究[J].淮海医药，2009,27（4），349—350.[5]于宏．牛蒡子的化学成分与生物活性[J].外医药·植物药分册，2007，22（6），244-245.[6]李鸣真，叶望云，陆付耳．中医“清热解毒”法实质的研究[J]．浙江中西医结合杂志，2000，10(8)：449-451.[7]陈奇．中药药理研究方法学(第2版)[M].北京：人民卫生出版社.2006，276-297.[8]国家药品监督管理局，中药新药研究的技术要求，1997.[9]王一荃，王祝鸣，童华．中药金衡灵急性毒性和反复给药毒性试验研究[J].中华临床医师杂志，2010，4（2）：36－41.[10]徐鑫，周昆，屈彩芹．香加皮配方颗粒的急性毒性和蓄积毒性实验研究[J].江苏中医药，2008，40（10）:117-118.[11]万启南，曹东，李游，叶勇，施燎明，李映雪．清热解毒扶正颗粒小鼠急性毒性试验[J]，云南中医中药杂志，2010，31（9）：72.[12]章元沛．药理实验方