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LOGO2020/3/241反转录（rt）授课人：薛高旭22020/3/24什么是反转录1970年Temin等在致癌RNA病毒中发现了一种特殊的DNA聚合酶，该酶以RNA为模板，根据碱基互补配对原则(其中U与A配对)，合成与RNA互补的DNA序列，因为这一过程与一般的转录步骤恰好相反，故称为反转录，催化此过程的DNA聚合酶叫做反转录酶(reversetranscriptase)。简单地说，反转录就是由mRNA到cDNA的过程。42020/3/24反转录的应用获得目的基因；构建cDNA文库基因表达与调控的研究52020/3/24反转录相关的背景知识——实验原理反转录酶以mRNA为模板，dNTP为底物，在引物的3′末端，按5′→3′方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链称为互补DNA(complementaryDNA,cDNA)。62020/3/24反转录相关的背景知识——第一链合成合成cDNA第一链时需要引物，目前常用的引物主要有三种，即Oligo（dT），随机引物和特异性引物。Oligo（dT）含有10～20个脱氧胸腺嘧啶核苷的寡核苷酸片段；随机引物是含有6～10个碱基的寡核苷酸片段；特异性引物：根据需要合成的能与mRNA特异性互补结合的引物。72020/3/24反转录相关的背景知识——第一链合成以Oligo（dT）为引物82020/3/24反转录相关的背景知识——第一链合成因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2%,所以与使用随机引物的方法相比,得到的cDNA数量和复杂度要低很多。这种cDNA合成的方法在cDNA文库构建中应用极为普遍，。缺陷：因为逆转录酶无法到达较长的mRNA分子的5’末端，因此，对于大分子量的较长的mRNA分子而言，特别麻烦。92020/3/24反转录相关的背景知识——第一链合成随机引物引导的cDNA合成:随机引物结合到mRNA后，并以此作为反转录的起点，在RT作用下合成cDNA。随机引物cDNA合成的方法不适合构建cDNA文库，一般用于克隆特定mRNA的5‘末端，如RT-PCR和5’-RACE，以及从带有复杂二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点区域获得cDNA。102020/3/24反转录相关的背景知识——第一链合成GSP引导的cDNA合成:是以与mRNA3’端配对的引物为起始，合成互补的DNA单链。为了充分利用GSP特异性的优点,应该使用具有较高热稳定性的逆转录酶，这样可以增加反应的严谨性。112020/3/24反转录相关的背景知识——第二链合成cDNA第二链的合成：即将上一步形成的mRNA-cDNA杂合双链变成互补双链cDNA的过程。cDNA第二链合成的方法有四种，自身引导合成法，置换合成法，引导合成法和引物－衔接头合成法。122020/3/24反转录相关的背景知识——第二链合成132020/3/24反转录相关的背景知识——第二链合成142020/3/24反转录相关的背景知识——第二链合成引导合成法优点：获得的双链cDNA能保留完整的5’端序列152020/3/24反转录相关的背景知识——第二链合成引物－衔接头合成法：162020/3/24反转录相关的背景知识——第二链合成优点：获得的双链cDNA能保留完整的5’端序列，且含有限制性酶切位点，可直接用于克隆172020/3/24反转录相关的背景知识——反转录酶大多数反转录酶都具有多种酶活性，主要包括以下几种活性：①以RNA为模板的DNA聚合酶活性；②RNaseH活性；③以DNA为模板的DNA聚合酶活性；④除此之外，有些反转录酶还有DNA内切酶活性，这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关。182020/3/24反转录相关的背景知识——反转录酶常用的两种反转录酶：M-MuLV,AMVM-MuLV逆转录酶（来自Moloey鼠白血病病毒）简介：MoloneyMurineLeukemiaVirus(莫洛尼氏鼠白血病病毒,M-MuLV)逆转录酶从E.coli菌株提取出来，此菌株含有一个克隆有M-MuLVRT基因的质粒，M-MuLV基因被删去了RNAaseH核心部分。特点：RNaseH活性超低，cDNA得率高。192020/3/24反转录相关的背景知识——反转录酶Note:M-MuLVRThasmuchlowerRNaseHactivitythanAvianMyeloblastosis(AMV)reversetranscriptase.(Fermentas)202020/3/24反转录相关的背景知识——反转录酶AMV逆转录酶（来自禽成髓细胞瘤病毒）简介：具有双重活性：①5’→3’依赖引物的聚合酶活性，可以以RNA或DNA作为模板；②具有3’→5’RaseH活性，可以降解RNA/DNA杂合体中的RNA，它需要Mg2+或Mn2+激活。AMV特点：高灵敏度，可以高效扩增低至1ng总RNA的模板。高热稳定性，适合于扩增复杂模板。212020/3/24实验操作——仪器涡旋仪，0.5ml微量离心管，恒温金属浴，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，移液器，移液器吸头。222020/3/24实验操作——试剂RNA,Oligo(dT),dNTP(10mMeach),RNasefreewater(DEPCtreated),5Xbuffer,RNaseinhibitor(40U/μl),ReverseTranscriptase.232020/3/24实验操作——具体步骤1）RNA提取：RNA提取质量的检测：①电泳：如果28S条带的亮度是18S的2倍说明提取的RNA质量好。②检测RNA溶液的吸光度通常，我们只看OD260/OD280的比值，提取质量较好的RNA比值应该在1.8-2.2之间。当R1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。当R2.2时，说明RNA已经水解成单核苷酸了。242020/3/24实验操作——具体步骤2）逆转录：A)在Microtube管中配置下列混合液：B)离心数秒使混合液聚集于Microtube管底部；C)65℃保温5分钟后迅速在冰上极冷2分钟以上；试剂名称使用量RNA1μlOligo(dT)1μldNTP1μlRNasefreewater7μl252020/3/24实验操作——具体步骤D)如果需要再离心数秒，使混合液聚集于管底部，然后再向管中加入下列反应液：试剂名称使用量上述混合液10μl5XPrimeScriptBuffer4μlRNaseInhibitor(40U/μl)0.5μlPrimeScriptReverseTranscriptase(200U/μl)0.5μlRNasefreewater5μlE)42℃，60min，接着70℃保温15min,然后冰上冷却得到cDNA溶液。262020/3/24实验操作——注意事项实验过程中防止RNA降解在冰上操作272020/3/24请思考第一次70度水浴，第一次冰浴在实验中起什么作用？cDNA第一链能指数扩增吗？RNaseH和RNaseA的区别？LOGO2020/3/2428Yourcompanyslogan