无模板法制备载肝素的聚电解质微囊及其表征

无模板法制备载肝素的聚电解质微囊及其表征朱保庆，邵颖娅，刘新荣，李娟，丁素玲北京理工大学生命科学与技术学院，北京（100081）E-mail:[e-mail]摘要：本研究采用无模板法利用分子间的静电作用力，在不添加表面活性剂的条件下，制备具有核壳结构的微囊；用扫描电子显微镜、透射电子显微镜、Zeta电位仪和共聚焦显微镜等对其进行了表征。结果发现，制备得到的微囊大小均一且可控，分散性良好；具有核壳结构，外层为肝素钠。以考马斯亮蓝和罗丹名B为模型药物，对比了微囊对具有不同电荷的分子的装载能力。该方法操作简单，重复性强，所得微囊在药物控释领域具有潜在的应用价值。关键词：聚烯丙铵；肝素钠；微胶囊；无模板法；静电相互作用中图分类号：R941引言微胶囊技术在食品、化妆品、固定化酶和药物控制释放中具有广泛应用[1]。目前，微胶囊的制备方法主要包括界面聚合法、原位聚合法、相分离法、喷雾干燥法及层层自组装法等[2]。其中，聚合法需要使用化学催化剂，相分离法需要使用有机溶剂，不易除去；喷雾干燥法需要特殊的设备，而层层自组装法[3-5]虽避免了上述缺点，但其制备过程中需反复离心洗涤，操作繁琐，不适于大规模生产。[6]Wong等（2005）报道了一种纳米粒子辅助的无模板制备微胶囊的新方法。该方法主要包括两步，首先将带正电的聚电解质（如聚烯丙铵、聚赖氨酸）溶液和多价阴离子溶液（如磷酸氢二钠、琥珀酸等）混合，通过离子键交联生成亚稳定的胶体；然后加入表面呈负电荷的纳米粒子，使其在胶体表面沉积从而生成具有核壳结构的微囊。随后，Wong等[6-9]成功的在为囊中包买了大分子物质酸性磷酸酶和小分子吲哚菁绿等。该方法操作简单，且在水相进行，无需催化剂、乳化剂和有机溶剂辅助，较之其他微胶囊制备方法优势明显。但是纳米粒子在体内循环代谢的方式[10]尚未研究透彻，为了避免纳米粒子带来的潜在毒性，我们拟采用带有负电荷的聚电解质替换纳米粒子，改进上述方法。低分子量肝素钠（LMWH）是一种硫酸化的糖胺聚糖，具有显著的抗凝血活性，已作为抗血栓药物进入临床[11]。LMWH分子含有大量的磺酸基团，带有负电荷；我们以LMWH取代纳米粒子包被聚烯丙铵/HPO2-4胶体，制备得到了具有核壳结构的微胶囊，用SEM、TEM、激光共聚焦显微镜等对其进行了分析表征；并对比了所得微胶囊吸附具有不同电荷的分子的能力。1本课题得到北京理工大学研究生创新基金(No.GA200808)和北京市科技基金项目(No.Y0905001000091)资助。-1-材料与仪器聚烯丙基铵盐酸盐（PAH,Mw~70kDa，sigma）；肝素钠（北京奥博星生物技术公司）；考马斯亮蓝R250,罗丹名B，罗丹名异硫氰酸酯(中国国药集团)；荧光素异硫氰酸酯（FITC，sigma）；其它试剂均购自北京化学试剂公司。实验中所用水均为去离子水。S-4200扫描电子显微镜，H-800透射电子显微镜（日立公司，日本）；TE2000-E激光共聚焦显微镜（尼康公司，日本）；TU1901紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Zetasizer3000Hs型激光散射粒度仪（马尔文公司，英国）；精密型万分之一电子天平BS224S（赛多利斯，德国）；F-2500FL荧光分光光度计（日立公司，日本）。2.2聚电解质的荧光标记1.2.1PAH的RITC标记250mgPAH溶于3mlDI水，用1MNaOH溶液调pH至8.5；将2mgRITC溶于250µlDMSO，与PAH溶液混合后，避光震荡，室温过夜；溶液转至透析带（8000-15000），透析液为去离子水，透析6h，中间换水一次。透析后用1MHCl调pH至6.0[12]。冷冻干燥呈固体后，-20℃保存。1.2.2肝素钠的FITC标记[13]参考Ruponen等（2001）的方法，利用FITC标记肝素钠。标记后的混合液直接过葡聚糖G75凝胶柱分离。洗脱液可以为0.1M的NaCl或NaAc溶液，两者未见明显区别。当使用长10cm,内径1cm的柱子，每次上样1~2ml可分出绿色、黄色两条带；而使用长为25cm，内径1cm的柱子，每次上样4ml可分离出绿色、黄色、浅黄色三条带。2.3聚电解质微囊的制备取100µlPAH水溶液（2mg/ml）置于2ml离心管，加入600µlNa2HPO4溶液（0.01M），震荡10秒后室温静置数分钟（10~30min）；加入600µl肝素钠水溶液，震荡10s混匀后，摇床室温反应20min。2000rmp离心5min，弃上清，加入适量去离子水，混匀[6]。悬液置于4℃冰箱保存。2.4微囊的表征2.4.1微囊的形态取25µl微囊悬液滴于盖玻片上自然风干后，用扫描电镜观察微囊的外部形态。微囊的内部结构分别用透射电子显微镜和激光共聚焦显微镜观察。2.4.2微囊的粒径取1ml微囊悬液，使用Zetasizer3000Hs型激光散射粒度仪测定十次，取其平均结果。2.5具有不同电荷染料的装载-取100µLPAH水溶液（2mg/ml）置于2ml离心管，加入600µLNa2PO4溶液（0.01M），震荡10秒后室温静置10min。加入200µL0.05mg/ml的考马斯亮蓝（或罗丹名B）溶液，震荡5min。加入400µl肝素钠溶液，混匀后继续震荡20min。2000rmp离心5min，观察上清和沉淀的颜色。-2-凝胶柱分离。洗脱液可以为0.1M的NaCl或NaAc溶液，两者未见明显区别。可随时间先后依次分离绿色、黄色、浅黄色三种产物。图1中红色曲线为未标记的肝素的uv-cis光谱；1-6为不同时间内收集到的洗脱液的光谱图，其中1、2为绿色条带，3-4为黄色条带，5-6为浅黄色条带。1、2较对照相比，238、280、500nm处分别增加了三个吸收峰。这三个吸收峰同FITC自身的光谱吸收峰相似。根据葡聚糖凝胶分离的原理，大分子的物质首先被洗脱，标记的肝素钠分子量增加，所以首先洗脱的绿色条带为FITC-Hep。图1肝素钠和FITC反应后混合液过柱分离不同时间收集的物质的紫外吸收谱3.2微囊的形态和大小以RITC标记的PAH制备浊液，添加FITC标记的肝素溶液，共聚焦显微镜观察肝素在整个微球中的分布，结果如图（2a，2b）。2-我们发现肝素包被在PAH/HPO4胶体外，形成具有核壳结构的微球。从图（2a，2b）中可以看到红色比绿色稍小，而绿色中空部分远远小于对应的红色部分，说明一部分肝素渗透到PAH/HPO2-4微核内部；即微囊具有核壳结构。这同TEM表征的结果（图2d）相符。SEM、TEM表征结果表明，微囊的大小为1微米左右，呈单分散状态。[6,14]上述结果表面，肝素钠作为带有负电荷的据电解质可以取代二氧化硅纳米粒子，同PAH/HPO2-4胶体结合，生成具有核壳结构的微囊。肝素钠的使用，可以赋予微囊抗凝血的特性，特别的微囊直径小于体内昀小毛细血管的直径，使其在药物的靶向输送中具有潜在的应用价值。-3-复合微囊的显微表征（a，b）激光共聚焦显微镜，PAH用RITC标记，HEP用FITC标记；（c）扫描电子显微镜；（d）透射电子显微镜。42-将PAH和HPO4水溶液混合生成胶体静置不同的时间后，加入肝素钠，室温振荡20min后，进行粒径分析。结果表明，静置10min所得微囊平均粒径（图3，左）为1096nm，静置20min所得微囊平均粒径（图3，右）为1726nm。Wong等[6]利用动态光散射(Dynamiclightscattering简称DLS)技术研究PAH和HPO2-4水溶液混合生成的胶体粒径随时间变化的规律，他们发现随着时间延长，所得胶体粒径变大，我们的结果同他们类似。2-图3PAH/HPO/HEP复合微囊的粒径分析43.3微囊对不同电荷模式药物的装载考马斯亮蓝带有负电荷，罗丹名B带有正电荷。图4中1号、4号离心管为经步骤1.5分别装载两者离心前微囊的状态；2号、3号离心管为离心后的结果。经过离心，考马斯亮蓝随微球富集到离心管底部，而罗丹名B仍在上清中。-4-考马斯亮蓝，不离心2考马斯亮蓝，离心（出现蓝色沉淀）3罗丹明B，离心（出现白色沉淀）4罗丹明B，不离心图4PAH/HPO42-/HEP复合微囊吸附不同电荷染料的结果比较上述结果表明，微囊可以包埋带有负电荷的染料分子。进一步的试验还发现，微囊可实现对BSA的装载，且具有很高的包封率（数据未列出）。4结论和展望采用无模板法制备得到了基于静电相互作用的外被肝素的聚电解质复合微胶囊。该方法操作简便，重复性好，且在水相中常温常压下进行，无需表面活性剂；制备得到的微胶囊粒径分布均一，大小可控，具有核壳结构。微胶囊可以有选择性的装载带有负电荷的分子。该微胶囊在药物缓释、酶反应器等领域具有潜在的应用价值，相关的研究工作正在进一步进行当中。5致谢北京理工大学材料科学与技术学院靳玉娟博士和中国科学院理化技术研究所石峰晖博士分别在荧光标记和扫描电子显微表征上给予了无私帮助，特此感谢。参考文献[1]J西.&M拉.可注射缓释制剂[M].北京:化学工业出版社,2005.[2]许时婴,张晓鸣&夏书芹.微胶囊技术---原理与应用[M].北京:化学工业出版社2006.[3]AngelatosA.S.,KatagiriK.&CarusoF.Bioinspiredcolloidalsystemsvialayer-by-layerassembly.SoftMatter[J],2006,2(1),18-23.[4]DeGeestB.G.,SandersN.N.,SukhorukovG.B.,DemeesterJ.&DeSmedtS.C.Releasemechanismsforpolyelectrolytecapsules.ChemicalSocietyReviews[J],2007,36(4),636-49.[5]PeyratoutC.S.&DahneL.Tailor-madepolyelectrolytemicrocapsules:Frommultilayerstosmartcontainers.AngewandteChemie-InternationalEdition[J],2004,43(29),3762-83.[6]RanaR.K.,MurthyV.S.,YuJ.&WongM.S.Nanoparticleself-assemblyofhierarchicallyorderedmicrocapsulestructures.AdvancedMaterials[J],2005,17(9),1145.[7]YuJ.,MurthyV.S.,RanaR.K.&WongM.S.Synthesisofnanoparticle-assembledtinoxide/polymermicrocapsules.ChemicalCommunications[J],2006,(10),1097-99.[8]WongM.S.Encapsulatingenzymesusingnanoparticle-assembledmicrocapsules.AbstractsofPapersoftheAmericanChemicalSociety[J],2005,230,U1040-U40.[9]YuJ.,YaseenM.A.,AnvariB.&WongM.S.Synthesisofnear-infrared-absorbingnanoparticle-assembledcapsules.ChemistryofMaterials[J],2007,19(6),1277-84.[10]LewinskiN.,Colvin