酶工程

第四章酶工程第一节酶工程概述一、酶及酶工程的概念（一）酶1．酶的定义酶是具有生物催化功能的生物大分子，按照其化学组成，可以分为蛋白类酶（P酶）和核酸类酶（R酶）两大类别。蛋白酶主要是由蛋白质组成，核酸类酶主要由核酸（RNA）组成。目前已发现的酶有7000种以上第一节酶工程概述一、酶及酶工程的概念2．酶的特性（1）酶催化作用的专一性强（2）酶催化作用的效率高（3）酶催化作用的条件温和3．酶的分类和命名第一节酶工程概述一、酶及酶工程的概念（二）酶工程狭义：是指在一定的生物反应器中，利用酶的催化作用，将相应的原料转化成有用物质的技术广义：是指研究酶的生产和应用的一门技术性学科，它包括酶的发酵生产、酶的固定化、酶的化学修饰、酶反应器和酶的应用等方面内容。第一节酶工程概述二、酶的发展历程1833年1896年1913年1926年1960年1965年1982年20多年来，新发现的核酸类酶越来越多第二节酶的发酵生产优点：①微生物生长繁殖快，生活周期短，产量高；②微生物培养方法简单，生产原料大多为农副产品，来源丰富，价格低廉，机械化程度高，经济效益高；③微生物菌株种类繁多，酶的品种齐全；④微生物具有较强的适应性和应变能力，可以通过适应、诱导、诱变及基因工程等方法培育出新的产酶菌种。第二节酶的发酵生产一、产酶菌种的筛选（一）优良菌株的标准一个优良的产酶菌种应具备以下几点：①繁殖快，产酶量高，生产周期短；②适应性强、易培养和控制，便于管理和降低生产成本；③产酶性能稳定，不易退化，不易受噬菌体侵袭；④产生的酶容易分离纯化；⑤菌种本身和代谢产物安全无毒，对生产人员、生产环境，酶的应用不会产生不良影响。第二节酶的发酵生产一、产酶菌种的筛选（二）菌株筛选过程主要包括以几个步骤：含菌样品的采集，菌种分离，产酶性能测定及复筛等。第二节酶的发酵生产一、产酶菌种的筛选（三）产酶常用的微生物1．细菌2．放线菌3．霉菌4．酵母菌第二节酶的发酵生产二、基因工程菌的构建理想的宿主载体系统应具备以下几个特性：①载体与宿主相容，携带酶基因的载体能在宿主中稳定维持；②菌体容易大规模培养，生长无特殊要求，且能利用廉价的原料；③所生产的目标酶占总蛋白质的比例较高，且能以活性形式分泌；④宿主菌对人安全、不分泌毒素。第二节酶的发酵生产三、微生物酶的发酵生产微生物酶的发酵生产是指在人工控制的条件下，有目的利用微生物培养来获得所生产需要的酶制剂。微生物酶的发酵生产包括菌种活化、菌种扩大培养、培养基制备和发酵生产等。微生物发酵产酶的一般工艺流程第二节酶的发酵生产三、微生物酶的发酵生产微生物酶的发酵生产是指在人工控制的条件下，有目的利用微生物培养来获得所生产需要的酶制剂。微生物酶的发酵生产包括菌种活化、菌种扩大培养、培养基制备和发酵生产等。微生物发酵产酶的一般工艺流程如图4-1所示。第二节酶的发酵生产三、微生物酶的发酵生产（一）菌种活化与扩大培养应用于生产时，保藏菌种必须接种于新鲜的斜面培养基或液体培养基，在合适的条件下培养一定时间，以恢复菌种的活力，称之为菌种活化。活化的菌种经过种子罐扩大培养后得到的菌种称一级菌种，可用作发酵罐大规模生产；如果生产规模非常大，还需将菌种再扩大培养一次，称为二级菌种。第二节酶的发酵生产三、微生物酶的发酵生产（一）菌种活化与扩大培养菌种活化与扩大培养工艺流程：菌种（原菌）→斜面试管→小三角瓶→大三角瓶→卡氏罐→一级种子罐→二级种子罐第二节酶的发酵生产三、微生物酶的发酵生产（二）发酵方法1.温度的控制枯草杆菌的最适生长温度为34～37℃，黑曲霉的最适生长温度为28～32℃。2.通气和搅拌在发酵过程中必须不断供给氧，一般通过供给无菌空气来实现；第二节酶的发酵生产三、微生物酶的发酵生产（二）发酵方法3.pH值的控制细菌和放线菌的生长最适pH值为6.5～8.0；霉菌和酵母的生长最适pH值为4～6；植物细胞的生长最适pH值为5～6。第二节酶的发酵生产三、微生物酶的发酵生产（三）培养基1.碳源2.氮源3.无机盐4.生长因子5.产酶促进剂第二节酶的发酵生产三、微生物酶的发酵生产（四）提高酶产量的措施1.添加诱导物酶作用底物、酶反应产物、酶底物类似物2.控制阻遏物浓度3.表面活性剂4.添加产酶促进剂第三节酶的分离纯化一、酶制剂生产的基本过程（一）细胞破碎第三节酶的分离纯化一、酶制剂生产的基本过程（二）酶的提取酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程，又称为酶的抽提。酶的提取方法第三节酶的分离纯化一、酶制剂生产的基本过程（三）沉淀分离第三节酶的分离纯化一、酶制剂生产的基本过程（四）离心分离（五）过滤与膜分离第三节酶的分离纯化一、酶制剂生产的基本过程（六）层析分离第三节酶的分离纯化一、酶制剂生产的基本过程（七）电泳分离带电离子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。电泳的方法很多。纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、自由电泳和等电聚焦电泳。第三节酶的分离纯化一、酶制剂生产的基本过程（八）萃取分离萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取中的两相一般为互不相溶的两个液相或其他流体。按照两相的组成不同，萃取可以分为有机溶剂萃取、双水相萃取、超临界萃取和反胶束萃取等。第三节酶的分离纯化一、酶制剂生产的基本过程（九）结晶结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。酶的结晶是酶分离纯化的一种手段。酶在结晶之前，酶液必须经过纯化达到一定纯度和浓度。第三节酶的分离纯化一、酶制剂生产的基本过程（十）干燥干燥是将固体、半固体或浓缩液中的水分或其他溶剂除去一部分，以获得含水分较少的固体物质的过程。物质经过干燥后，可以提高酶的稳定性，利于产品保存、运输和使用。常用的干燥方法有真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥和吸附干燥等。第三节酶的分离纯化二、酶的纯度与酶活力酶活力是指在一定条件下，酶所催化的反应初速度。1961年国际生物化学与分子生物学联合会规定：在特定条件下（温度可采用25℃，pH值等条件均采用最高条件），每1min催化1μmol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位，这个单位称为国际单位(IU)。第三节酶的分离纯化三、酶制剂的保存（一）温度（二）缓冲液（三）氧化/还原（四）蛋白质的浓度及纯度第四节酶分子的改造一、酶分子修饰酶分子修饰是指通过各种方法使酶分子结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术。主要包括金属离子置换修饰、大分子结合修饰、侧链基团修饰、肽链有限水解修饰、核苷酸链有限水解修饰、氨基酸置换修饰和酶分子物理修饰等。第四节酶分子的改造一、酶分子修饰酶分子修饰是指通过各种方法使酶分子结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术。主要包括金属离子置换修饰、大分子结合修饰、侧链基团修饰、肽链有限水解修饰、核苷酸链有限水解修饰、氨基酸置换修饰和酶分子物理修饰等。第四节酶分子的改造一、酶分子修饰（一）金属离子置换修饰（二）大分子结合修饰（三）侧链基团修饰（四）侧链水解修饰第四节酶分子的改造二、酶的蛋白质工程酶的蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，酶的蛋白质工程致力于天然蛋白质的改造，制备各种定做的蛋白质。第四节酶分子的改造三、生物酶的人工模拟人工合成酶：在结构上具有两个特殊部位：底物结合位点、催化位点。固氮酶的模拟、过氧化氢酶、生物印迹技术抗体酶：本质上是免疫球蛋白，在其易变区域赋予了酶的活性。抗体酶具有较高的活性，其催化效率远比模拟酶高。第五节酶与细胞的固定化一、酶的固定化固定化酶是指在一定空间内以闭锁状态存在的酶。第五节酶与细胞的固定化一、酶的固定化（一）载体结合法1.物理吸附法2.离子吸附法3.共价结合法4.螯合法第五节酶与细胞的固定化一、酶的固定化（二）包埋法（三）供价交联法第五节酶与细胞的固定化二、细胞的固定化（一）吸附法（二）包埋法将细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化细胞的方法称为包埋法。包埋法可分为凝胶包埋法、纤维包埋法和微胶囊法。其中凝胶包埋法应用最广泛第五节酶与细胞的固定化三、固定化酶的性质（一）酶的活性变化（二）酶稳定性提高（三）最适pH的变化（四）最适温度提高（五）反应动力学常数变化第五节酶与细胞的固定化四、固定化酶的指标（一）相对酶活力（二）酶的活力回收率（三）固定化酶的半衰期第六节酶反应器一、酶反应器的基本类型（一）搅拌罐型反应器（二）固定床型反应器（三）流化床型反应器（四）膜式反应器间歇式酶反应器第六节酶反应器二、酶反应器的设计原则底物的酶促反应动力学以及温度、压力和pH等操作参数对反应器的影响，反应器的类型和反应器内流体的流动状态及传热特性，生产工艺流程和生产量的需求等。在设计酶反应器时，还应在经济、社会、时间和空间上实现最优化。第六节酶反应器三、酶反应器的性能评价（一）空时（二）转化率（三）生产强度第六节酶反应器四、酶反应器的操作（一）酶反应器中微生物污染的控制（二）酶反应器中流动状态的控制（三）反应器中恒定生产能力的控制第七节生物传感器生物传感器是一种由生物学、医学、电化学、光学、热学及电子技术等多学科相互渗透而发展起来的分析检测装置，具有选择性高、分析速度快、操作简单和价格低廉等特点，而且能进行连续测定和在线分析，甚至可以活体分析。生物传感器的诞生是酶技术与信息技术结合的产物。第七节生物传感器一、生物传感器的原理生物传感器是使用固定化的生物分子结合换能器，用来侦测生物体内或生物体外的环境化学物质或与之起特异性交互作用后产生响应的一种装置。第七节生物传感器一、生物传感器的原理工作原理：待测物质经扩散作用进入固定化生物敏感层，经分子识别，发生生物化学反应，产生的信息继而被相应的化学或物理换能器转化为可定量和可处理的电信号，再经仪表的放大和输出，便可获得待测物的相关数据信息。第七节生物传感器一、生物传感器的原理生物传感器由两个主要关键部分所构成。一部分是生物传感器信号接收或产生部分，来自于生物体分子、组织部分或个体细胞的分子辨认组件；另一部分属于硬件仪器组件部分，主要为物理信号转换组件。第七节生物传感器二、生物传感器的分类酶传感器、微生物传感器、免疫传感器、组织传感器、场效应晶体管传感器第七节生物传感器三、生物传感器的发展前景（一）功能更加全面，朝微型化方向发展（二）智能化程度更高第八节酶的应用一、酶应用的领域第八节酶的应用二、酶应用的例子（一）酶在葡萄糖生产中的应用葡萄糖的酶法生产工艺流程：淀粉→调浆→液化→糖化→脱色→过滤→离子交换→真空浓缩→结晶→分离→干燥→葡萄糖产品第八节酶的应用二、酶应用的例子（二）酶在疾病诊断方面的应用【实验实训】淀粉酶在果葡糖浆生产上的应用一、实验目的掌握淀粉酶水解淀粉的原理，了解温度、pH值和淀粉酶添加量的变化对果葡糖浆得率的影响。二、实验原理淀粉水解的方法有酸解法、酸酶结合法和酶法三种。酶法是采用酶液化和酶糖化得到葡萄糖液的一种工艺。此法已经广泛用于淀粉糖品的生产，其中果葡糖浆的生产即采用双酶法。淀粉酶在果葡糖浆生产上的应用三、材料用具（一）材料玉米淀粉或薯类淀粉（二）试剂α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶（糖化酶）、异构酶、浓度0.1%稀盐酸、0.1mol/LCaCl2溶液、0.01mol／L的硫酸镁溶液（三）器具500ml烧杯、量筒、微量移液器、磁力搅拌器、离子交换树脂、真空浓缩器、恒温干箱、连续蒸发器、异构酶柱桶、酸度计、高效液相色谱、封口膜淀粉酶在果葡糖浆生产上的应用四、制备方法（一）工艺流程淀粉酶在果葡糖浆生产上的应用四、制备方法（二）操作要点1.调浆与液化2.糖化3.糖化液精制4.酶法异构葡萄糖为果糖5.果