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第七讲电泳技术※通过本章学习应掌握的内容电泳的概念电泳的基本原理电泳技术的分类基本的电泳系统组成常规聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离原理SDS-PAGE的分离原理何谓等电聚焦？如何形成载体两性电解质pH梯度？7.1电泳概念、基本原理与电泳技术的分类7.1.1定义定义——荷电的胶体粒子在电场中的移动；电泳技术是进一步分离核酸和蛋白质等溶质的基本方法。当外界缓冲液的pH值偏离溶质的等电点时，点样到惰性支持物上的样品中的溶质组分在电场中便会向其带电方向相反的电极移动，在一定的外界条件（主要指电场强度、缓冲液pH值和离子强度）下，不同溶质分子由于所带电荷性质、数量以及分子大小、形状不同，在电场中的泳动方向和速度不同而被分离。电泳决定于环绕每个离子的离子雾中的扩散双电层，离子尺寸越大、溶液中的离子强度越高时，电泳现象变得越明显。因此，电泳现象中的表面电势和双电层的因素起着决定性的作用。7.1.2电泳的原理蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它大分子的相互作用。带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺寸大小和形状、分子所带电荷或分子的生物学与化学特性。电泳迁移率（mobility）:在电位梯度E的影响下，带电颗粒在时间t中的迁移距离d。其单位是cm2·sec-1·V-1电泳迁移率的不同提供了从混合物中分离不同物质的基础7.1.3电泳的大致分类1、依据电泳分离原理，现有三种形式的电泳分离系统（1）区带电泳（zoneelectrophoresis，ZEP）：是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后在介质上加电场，带电颗粒在支持介质上或支持介质内迁移，在电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带，可用染色等方法显示出来，特别是在凝胶中进行的区带电泳，由于凝胶兼具有分子筛的作用，分辨率大大提高，是当前应用最广泛的电泳技术。（2）移动界面电泳（movingboundaryelectrophoresis）：是把电场加在生物大分子溶液和缓冲溶液之间的界面上，带电颗粒的移动速度通过光学方法观察界面的移动来测定。由于分离效果差，已被其他电泳技术所取代。（3）稳态电泳（steadystateelectrophoresis）：带电颗粒在电场作用下电迁移一定时间后达到一个稳定状态，此后，电泳条带的宽度不随时间的变化而变化，如等速电泳、等电聚焦电泳。图各种电泳技术分离原理示意图（a）区带电泳；（b）移界电泳；（c）等速电泳；（d）等电聚焦2、按有无固体支持物分类（1）自由电泳：是在溶液中进行的电泳，可分为①显微电泳（也称细胞电泳），即在显微镜下直接观察细胞或细菌等的电泳行为；②移界电泳；③柱电泳，是在层析柱中进行的电泳，用密度梯度保持分离区带不再混合，或再配合pH梯度则成为等电聚焦电泳；④自由流动幕电泳；⑤等速电泳等。自由电泳存在着一定缺陷，在电泳过程中的热效应和扩散作用造成液柱的对流和蛋白区带加宽，降低了电泳的分辨率。（2）支持物电泳：是在固体支持物上进行的电泳，形式多样。支持介质的作用主要是为了防止电泳过程中的机械干扰、温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。支持物可使用无阻滞的滤纸、乙酸纤维素膜等，也可以使用高密度凝胶作为作为支持介质，如淀粉凝胶、琼脂凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。仪器可用水平或直立的槽、柱或毛细管。3、区带电泳的主要技术具有支持介质的区带电泳具有防止电泳过程中的对流和扩散，可使被分离的成分得到最大分辨率的分离；区带电泳中的常用技术载体电泳：粉末电泳、纸电泳、凝胶电泳、聚焦电泳无载体电泳：自由电泳、毛细管电泳7.2凝胶电泳的支持介质作为电泳支持介质必须具有：化学惰性、不干扰大分子的电泳过程，化学稳定性好、均匀、重复性好、电内渗小等特性。7.2.1聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel,PGA）由丙烯酰胺和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和增速剂的作用下，聚合而成；1、丙烯酰胺的聚合烯酰胺的聚合通常是由化学或光化学过程完成的，通常采用过硫酸铵、过硫酸钾或核黄素（引发剂）来引发该过程；以N，N，N’，N’-四甲基乙二胺（TEMED）为增速剂。该引发-增速的催化系统实质是自由基催化的氧化-还原过程。丙烯酰胺的化学聚合是由过硫酸铵在碱性条件下，产生游离氧自由基引发单体丙烯酰胺成为自由基状态，经过一系列的自由基反应得到的聚合物；2、影响聚合的主要因素（1）引发剂和增速剂的浓度：浓度小易导致聚合速度慢；浓度过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变；一般控制使聚合过程在40~60分钟内完成。（2）系统pH值：酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在一个最佳pH值，以获得最佳的聚合结果；（3）温度：低温下聚合导致凝胶变脆和混浊；适当提高温度可以是凝胶透明而有弹性；（4）分子氧：分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合；抽气（5）系统纯度：金属离子会影响凝胶的聚合；3、聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分子筛效应在使用凝胶介质的电泳中，由于电泳介质具有高粘度和高的摩擦阻力，因此不仅可以防止对流，而且可以把扩散减到最小。凝胶中的大分子分离取决于它的电荷、尺寸和形状凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于它的尺寸筛分能力（sizesievingcapacity），这种现象被称为分子筛效应（molecularsievingeffect）7.2.2琼脂糖凝胶的性能、结构与特点1、琼脂糖凝胶：从琼脂中精制分离出的胶状多糖，其分子结构大部分是由1，3连接的β-D吡喃半乳糖和1，4连接的3，6脱水α-D吡喃半乳糖交替形成的；2、特点：（1）琼脂糖凝胶孔径较大，0.075%琼脂糖的孔径为800nm，可以分析百万道尔顿分子量的大分子，但分辨率较凝胶电泳低。（2）机械强度高：可以在浓度1%以下使用；（3）无毒；（4）染色、脱色程序简单，背景色较低；（5）热可逆性；（6）生物中性：一般不与生物材料结合；（7）电内渗（EEO）大：对于对流电泳有益7.3电泳系统的基本组成（1）电泳槽：是凝胶电泳系统的核心部分，管式电泳槽、垂直板电泳槽、水平板电泳槽（2）电源:聚丙烯酰胺凝胶电泳200~600V，载体两性电解质等电聚焦电泳1000~2000V，固相梯度等电聚焦3000~8000V（3）外循环恒温系统:高电压会产生高热，需冷却；（4）凝胶干燥器:用于电泳和染色后的干燥；（5）灌胶模具：制胶，玻璃板和梳子；（6）电泳转移装置：利用低电压，大电流的直流电场，使凝胶电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上，如PVDF膜（7）电泳洗脱仪：回收样品（8）凝胶扫描和摄录装置：对电泳区带进行扫描，从而给出定量的结果。7.4常规聚丙烯酰胺凝胶电泳7.4.1原理由于聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是多孔介质，不仅能防止对流，把扩散减少到最低；而且其孔径大小与生物大分子具有相似的数量级，能主动参与生物分子的分离，具有分子筛效应。因此，在使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离时，在电泳过程中不仅取决于蛋白质的电荷密度，还取决于蛋白质的尺寸和形状。PAGE可以用圆盘电泳、垂直电泳或水平电泳7.4.2电泳前的准备工作1、缓冲系统的选择：（a）保证蛋白质的溶解性能、稳定性以及生物活性的保持；（b）电泳时间和分辨率：从理论上讲PAGE可以在任何pH进行，但实际上过酸或过碱的条件下将发生某种水解（脱酰胺）。因此，pH应限制在3~10之间。缓冲系统的选择原则是两种标准的对立权衡（a）如果缓冲液的pH选择在远离样品中各种蛋白的等电点，蛋白质分子所带电荷的密度大，电泳时间短，区带细而窄；（b）如果缓冲pH选择在靠近被分离样品的一种或几种蛋白质的等电点，则蛋白质分子之间的电荷密度差别大，分辨率就高；因此，常常选择pH8.0~9.5的缓冲，常用的缓冲液有Tris-甘氨酸（pH8.3~9.5），Tris-硼酸(pH8.3~9.3)和Tris-醋酸（pH7.2~8.5）2、凝胶浓度的选择由于PAGE电泳分离不仅取决于蛋白质的电荷密度，而且取决于分子的大小、形状。因此，凝胶的分子筛效应（即凝胶的孔径与电泳的分辨率、电泳速度）密切相关。根据凝胶孔径与被分离分子的大小和形状，可以将凝胶分为：（a）非排阻性凝胶（unrestrictivegel）:浓度0.7~1.0%的琼脂糖凝胶；（b）排阻性凝胶（restrictivegel）：浓度大于1%的琼脂糖凝胶和常规PAGE凝胶浓度太大，孔径小于样品分子尺寸，电泳时蛋白质分子不能进入凝胶，样品仍留在加样位置；凝胶浓度太小，孔径太大，样品中各种蛋白质分子均随缓冲液推进，不能得到很好的分离；7.4.3PAGE的具体操作过程（1）制胶：确定凝胶配方（凝胶、引发剂、增速剂的浓度和缓冲液），使用灌胶模具灌胶；（2）样品准备：选择合适的样品缓冲液、确定合适的样品浓度（1~2mg/L，考染），加样（溴酚蓝）；（3）电泳：4~6小时，待溴酚蓝前沿到达阳极底部；（4）检测：紫外扫描或染色（考马斯亮蓝R-250、银染色—灵敏度比考染高100倍、荧光探针）；（5）照相、凝胶干燥；（6）定量测定；7.5SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质亚基分子量以及未知蛋白质分子量的测定；特点：设备简单、操作简便、测定快速、重复性高、样品无需纯化。（1）SDS-PAGE的原理蛋白质分子的解聚SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响。7.6载体两性电解质pH梯度等电聚焦等电聚焦（isoelectrofocusing）,IEF利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。利用等电聚焦技术分离、分析的对象仅限于蛋白质和两性分子。根据建立pH梯度的原理不同，梯度有分为载体两性电解质梯度（CarrierampholytespHgradient）和固相梯度。载体两性电解质pH梯度等电聚焦原理载体两性电解质pH梯度等电聚焦就是在支持介质中加入载体两性电解质，通以直流电后在两极之间形成稳定、连续和线性的pH梯度，当带电的蛋白质分子进入该体系时，便会产生移动，并聚集于相当于其等电点的位置。等电聚焦技术的关键在于pH梯度的建立载体两性电解质的概念：作为载体两性电解质应该具有以下特点：（a）应该是两性的，使它们在分离柱中也能达到一个平衡位置；（b）应该可以作为“载体”，两性电解质不能用于等电聚焦，只有载体两性电解质，即具有好的导电性和好的缓冲能力的化合物才能用于等电聚焦。pH梯度的形成在没有电场时，载体两性电解质的pH值大约是该溶液pH范围的平均值，所有载体两性电解质分子都荷电。当引入电场时，载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带有最低等电点的分子（荷最多负电）将最快地向阳极移动；当它达到净电荷为0的位置时才停止，这个位置靠近阳极，由于它具有高的缓冲能力，使环境溶液的pH等于分子本身的pI。其次，一些低pI的载体两性电解质（荷其次多的负电）也向阳极移动，直到它的净电荷减少到0才停止。同样的，其周围环境溶液pH值也等于它本身的pI。依次类推，所有的载体两性电解质分子用增加pI级数的方法将分别在阳极、阴极之间到达它们自己的位置，从而给出一个pH梯度。水平等电聚焦电泳制胶：溶液配制（丙烯酰胺、N，N’-甲叉双丙烯酰胺、载体两性电解质等），灌胶；