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第二节基因工程的基本操作程序生长快、肉质好的转基因鱼(中国)基因工程（DNA重组技术）是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定概念：一、目的基因的获取目的基因：主要是指编码蛋白质的基因，例如，与优良品质相关的基因，与生物药物和保健品相关的基因，以及与工业所需酶相关的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。获取目的基因的方法：人工合成从基因文库中获得目的基因PCR技术扩增从基因文库中获得目的基因1、概念:将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因库。2、分类:基因组文库部分基因文库(如cDNA文库)基因组文库:将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶，将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后，将这些DNA片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段，也就是说，这个群体包含了这种生物的所有基因，叫做这种生物的基因组文库。cDNA文库如果用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA（也叫cDNA)片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库。1、怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因?根据基因的核苷酸序列，基因的功能，基因在染色体上的位置，基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特殊性来获得目的基因。利用PCR技术扩增目的基因1、定义：PCR是多聚酶链式反应的缩写，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，通过这一技术，可以在短时间内大量扩增目的基因。2、原理：它是利用DNA双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数方式增长(约2n，其中n为扩增循环的次数）。3、基本前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。4、过程：（1）加热至90℃~95℃，使双链DNA模板两条链之间的氢键打开，变成单链DNA，作为互补链聚合反应的模板。(DNA变性）（2）将温度降至55℃~60℃，使两种引物分别与模板DNA的一端互补序列互补配对。（退火）（3）将温度升至70℃~75℃，在耐高温的DNA聚合酶催化作用下，使DNA链延伸。（延伸）利用PCR技术扩增目的基因PCR扩增仪人工合成目的基因基因较小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成仪人工合成.二、基因表达载体的构建基因表达载体的模式图抗生素抗性基因将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？表达载体的构建使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且以遗传给下一代，同时是目的基因能够表达和发挥作用。基因表达载体组分目的基因启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首段，它是RNA聚合酶识别的结合部位，有了它才能驱动基因转录mRNA。终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的末端，使转录在这里终止。标记基因：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构.②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键.③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少.④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意三、将目的基因导入受体A、将目的基因导入植物细胞农杆菌转换法（最常用）基因枪法花粉管通道法1、农杆菌转换法农杆菌：是一种在土壤中生活的微生物，，能在自然界感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。原理：当植物受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引龙杆菌移向这些细胞，这时龙杆菌的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA)可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。转化过程2、基因枪法原理：利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。应用：单子叶植物，但成本较高3、花粉管通道法B、将目的基因导入动物细胞1、方法：显微注射法2、步骤：（1）首先将含有目的基因的表达载体提纯。（2）从雌性体内取出受精卵，采用显微注射仪进行显微注射。（3）再将注射了目的基因的受精卵，经胚胎早期培养一段时间后，再移植到雌性动物的输卵管或子宫内，使其发育称为具有新现状的动物。C、将目的基因导入微生物细胞1、受体：由于原核生物具有繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少等特点，因此。早期的基因工程操作都用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。2、导入方法：（1）首先用Ca2+处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。（2）将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液与感受态细胞融合，在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。四、目的基因的检测与鉴定1、受体细胞的DNA是否插入了目的基因。2、目的基因是否转录出了mRNA。3、检测目的基因是否翻译成蛋白质。受体细胞的DNA是否插入了目的基因1、方法：DNA分子杂交技术2、步骤：（1）将转基因生物的基因组DNA提取出来。（2）制备一个含有目的基因的DNA片段，在片段上用同位素标记，作为探针。（3）使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，说明目的基因已经插入染色体DNA中。目的基因是否转录出了mRNA1、方法：分子杂交技术2、步骤：（1）将转基因生物的mRNA提取出来。（2）制备一个含有目的基因的DNA片段，在片段上用同位素标记，作为探针。（3）使探针与mDNA杂交，如果显示出杂交带，说明目的基因转录出了mRNA。检测目的基因是否翻译成蛋白质1、方法：抗原——抗体分子杂交2、步骤：（1）将转基因生物的蛋白质提取出来。（2）制备一个相应的抗体，抗体用同位素标记。（3）使抗体与蛋白质杂交，如果显示出杂交带，说明目的基因已经形成蛋白质。1、在已知某小片段基因碱基序列的情况下，获得该基因的最佳方法是A．用mRNA为模板逆转录合成DNAB．以4种脱氧核苷酸为原料人工合成C．将供体DNA片段转入受体细胞中，再进一步筛选D．由蛋白质的氨基酸序列推测mRNA答案：B2、下列高科技成果中，根据基因重组原理进行的是（）①我国科学家袁隆平利用杂交技术培育出超级水稻②我国科学家将苏云金杆菌的某些基因移植到棉花内，培育出抗虫棉③我国科学家通过返回式卫星搭载种子培育出太空椒④我国科学家通过体细胞克隆技术培养出太空牛A．①B．①②C．①②③D．②③④答案：B3、镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因的碱基序列发生了改变。检测这种碱基序列改变必须使用的酶是（）A．解旋酶B．DNA连接酶C．限制性内切酶D．RNA聚合酶解析：检测这种碱基序列改变需将被测基因从DNA上切下来进行扩增，该过程需要限制性内切酶。在扩增后，通过热变性即可使待测基因解旋成单链，与已知碱基序列的贫血病基因制成的DNA探针进行分子杂交，根据形成双链的情况即可测知其碱基序列，此过程无需解旋酶，更不需要形成重组DNA分子所需的DNA连接酶和基因转录所需的RNA聚合酶。据以上分析可知，必须使用的酶是C、限制性内切酶。答案：C4、下列关于基因工程的叙述，正确的是（）A．基因工程经常以抗菌素抗性基因为目的基因B．细菌质粒是基因工程常用的运载体C．为培育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体D．通常用一种限制性内切酶处理含目的基因的DNA,用另一种处理运载体DNA解析：基因工程经常以抗菌素抗性基因为标记基因；质粒是基因工程常用的运载体；通常用同一种限制酶切割目的基因和运载体，以获得相同的黏性末端；受体细胞可以是受精卵，也可以是体细胞。答案：B5、利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列各项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是A．棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因B．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNAC．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列D．酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白答案：D