流式细胞仪(Flow-Cytometer)基本原理

1、流式细胞术简介流式细胞术（FlowCytometry，FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。流式细胞仪（FlowCytometer）是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种高科技仪器。流式细胞术的特点检测对象：单细胞悬液或生物颗粒；检测参数：多参数；检测特点：单细胞水平分析；检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒；检测结果：精度高、准确性好；可对目标细胞进行分选；2、流式细胞术光信号检测光信号的类型散射光信号：与标记荧光素无关，是细胞的固有参数。前向散射光(forwardscatter,FSC)；侧向散射光(sidescatter,SSC)。荧光信号自发荧光：微弱（核黄素、色素分子等）；特异荧光：荧光素分子发出的的荧光比自发荧光强很多倍。前向散射光FSC激光器正前方1-6度方向上有比较强的衍射光，即前向散射光，FSC强度是d/λ的函数(λ表示波长，d指细胞大小)，所以FSC反映被测细胞的体积大小和活力。侧向散射光SSCSSC方向与激光束和液流形成的平面相垂直，亦称90度散射光，其信号强度反映细胞内部颗粒度和精细结构的变化。散射光的作用实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。粒细胞单核细胞淋巴细胞红细胞、死细胞和碎片通过FSC/SSC散点图，gate出目标细胞进行分析。死细胞或碎片粘连细胞肿瘤细胞株FSC/SSC散点图死细胞加药处理后FSC/SSC散点图阈值：Threshold/Trigger阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的死细胞。FSC反映细胞体积的大小，FCM应用时常选取FSC设定阈值。5%32%默认阈值升高阈值后荧光素和荧光信号荧光：荧光素的电子吸收光的能量由低能态转变为高能态，再回到低能态时释放出的光。发射波长(荧光波长)Emissionwavelength激发波长Excitationwavelength＜常用荧光素499nm：蓝色荧光（Blue）；500-549nm：绿色荧光（Green）；550-584nm：黄色荧光（Yellow）；585-615nm：橙色荧光（Orange）；616-700nm：红色荧光（Red）；≥700nm：远红外荧光（Far-Red）。标记抗体的荧光素荧光素分子激发光波长（nm）发射光波长（nm）中文名FITC490520异硫氰酸荧光素PE488575藻红蛋白PerCP490675多甲藻叶绿素蛋白APC650660别藻青蛋白PE-Cy5496/546670藻红蛋白-花青素5PE-Cy7496/546767藻红蛋白-花青素7AlexaFlour488495519AlexaFlour647650665核酸荧光染料PI（碘化丙啶535,623）可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。7-AAD（7-氨基放线菌素D545,647）以插入的方式与DNA链的G-C碱基对结合，不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。DAPI（4,4,6-二脒基二苯基吲哚358,456）可以非嵌入方式与DNA链上的A-T碱基对特异性结合。变异系数明显小于其他染料，一种理想的DNA定量染料。Hoechst（343,450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。PY（派若宁560,573）RNA染料，能进入活细胞。AO（吖啶橙509,525）DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光，RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。4、流式图和流式结果流式数据的存储：列表模式（listmode），记录了每个细胞的所有参数的信息。每个细胞检测5个参数，那么获取10000个细胞，容量为5×10000（字或双字）。Event#FSCSSCFL1FITCFL2PEFL3APC110050010650421105057007006390480720670104954901572015……•常用分析软件–MACSQuantify–CellQuest–Diva–FlowJo–WinMDI–FCSExpress•单参数直方图(Histogram)•双参数数据显示：散点图(DotPlot)伪彩图(Pseudo-colorPlot)等高线图(ContourPlot)密度图(DensityPlot)假三维图(Pseudo3DPlot)•三维图(3DPlot)流式数据的显示方式细胞的某一单参数数据的统计分布图，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，单位是道数，纵坐标一般是细胞数。直方图HistogramEvent#FL1FITC11027003720415……0…………10…………100…………1000CountsFITC荧光强度横坐标既可以是线性的，也可以是对数的。DNA倍体分析抗原表达分析Overlay图直方图Histogram散点图DotPlot散点图中每个点代表一个细胞，X轴与Y轴分别代表一种参数，优点是比直方图直观。FL1FL2散点图和伪彩图等高图和密度图等高图：类似于地图中的等高线，同一条线上的细胞数目相等，越在里面的曲线代表细胞数目越多。密度图：点密度越大的地方细胞越多，点密度越小的地方细胞少。假三维图和三维图CountsSSC→流式结果十字门线性门流式分析常见问题FSC和SSC很重要―FSC前向散射光：反映细胞的体积大小和活力；―SSC侧向散射光：反映细胞的颗粒度。CD8aAlexaFluor700CD4APC-Cy7FSC-ASSC-A双参数散点图比直方图更“可靠”有的抗原荧光太弱，或背景荧光太强，双参数散点图更能反映真实情况。设门技巧：多用矩形门粘连细胞的去除流式分析的是单细胞，粘连细胞影响实验结果。―周期分析时，双联体细胞的去除；―流式分选时，粘连细胞的去除。G0/G1双联体细胞G2/M细胞FL2-WFL2-WFL2-HFL2-HFL2-WFL2-A电脉冲信号的面积A、高度H和宽度WCreationofaVoltagePulseTimeVoltsPulseAreaPulseHeightPulseWidth0QuantificationofaVoltagePulseWidth=Area/HeightA、H和W的组合去粘连细胞5、流式对照的设置A、空白对照NegativeControl细胞内物质自身也发出荧光，能被FCM灵敏的检测到，这种未染色的细胞自身发出的一些荧光称为自发荧光。设置空白对照（未染色的细胞），用以区分细胞的自发荧光和特异性荧光，避免假阳性的结果。流式结果中荧光强弱是一个相对值，光电倍增管电压越大，电子信号越强；电压越小，信号越弱。通过调节电压，使阴性对照管的荧光强度处于阴性的位置，实验组的荧光值都是相对对照组。001001002B、同型对照IsotypeControl非特异性染色抗体的Fc段可以与细胞表面的Fc受体非特异性结合；抗体进入胞内，不容易洗脱，造成非特异性染色。同型对照是指使用与实验抗体相同种属来源、相同剂量及同种免疫球蛋白的相同亚型的抗体作为对照，用于消除抗体非特异性结合到细胞上而产生的背景荧光。实验抗体：FITC-CD3单克隆抗体为鼠IgG1亚型抗体;同型对照：未免疫小鼠血清纯化的IgG1，并标记FITC，相同剂量。C、单标对照SingleStainingControl由于荧光素的宽发射谱特点，荧光通道间有光谱重叠现象。多色流式实验的时候需要通过补偿调节消除光谱重叠影响。FL1530/30FL2585/42WavelengthFITC发射谱PE发射谱补偿调节方法：FL-1(FITC)FL-2(PE)FL-1(FITC)FL-2(PE)FL2-%FL1FL-1(FITC)FL-2(-)FL-1(-)FL-2(PE)FL1-%FL2BeforeCompensationAfterCompensationFITC单标PE单标什么样的补偿最合适？单染管的阴性群体和阳性群体在所需调节通道的荧光Median值相等时为最合适的补偿。UncompensatedCompensatedFL1-FITCstainFL2-nostainFL1-FITCstainPE-MediannegPE-MedianposPE-Medianneg=PE-MedianposPE-MediannegPE-MedianposFL1-FITCstainOvercompensated多色实验中，阴性对照和单染对照并不是严谨的设门对照，FMO对照区分阴性群体和阳性群体更准确。FluorescenceMinusOne荧光减一对照D、FMO对照FITC(-)PEPE补偿调节引起背景荧光增强。颜色越多背景荧光越强，限制了多色流式技术的发展。多色实验中，弱表达抗原必须设置FMO作为gatingcontrol。双标试验中，单染管相当于FMO对照。Treg检测中CD4/CD25/IgG即为FMO对照。