流式细胞术原理

流式细胞术苏黎北京大学医药卫生分析中心细胞分析室联系电话：82805034828024372流式细胞仪内部结构•光学系统激光光源光收集系统•液流系统流动室液流驱动系统•电子系统光电转换器数据处理系统•细胞分选系统喷嘴电偏转板样品收集器3•流式细胞仪与血细胞检测仪的共同特点：对液体中的各种细胞及其多种特性进行定量分析。教学参考书流式细胞术的原理和应用。宋平根，李素文主编。北京师范大学出版社。1992.3实用流式细胞术彩色图谱。王书奎，周振英主编。上海第二军医大学出版社。2004.4临床流式细胞分析。王建中主编。上海科学技术出版社。2005.8流式细胞术原理与应用教程。吴后男编。北京大学医学出版社。2008.24流式细胞仪的结构与原理流式细胞仪的数据获取与分析流式细胞术的样本制备流式细胞术的应用流式分选原理及其应用5流式细胞仪的结构与原理流式细胞术和流式细胞仪的简介流式细胞仪的结构流式细胞仪的信号检测原理6•什么是流式细胞术流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种对单个细胞或生物颗粒的物理或化学特性进行快速测量和定量分析的方法，同时也是一项可以用物理方法对细胞亚群或亚细胞结构进行分离和富集的高科技技术。流式细胞仪（FlowCytometer）：就是进行流式细胞分析的仪器，是一种集激光技术、流体力学技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞化学技术、抗体技术为一体的新型高科技仪器。7•流式细胞术的特点分析对象：流动的单细胞或生物颗粒悬液分析速度：快速（最高达数万个细胞/秒）检测内容：细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、蛋白质、抗原、离子或核酸等）检测参数：多参数（两个散射光参数、多个荧光参数）可同时测定多种可溶性细胞成分：流式微球阵列技术(CytometricBeadsArray,CBA)检测结果：精度高、准确性好、可重复性好8•流式细胞仪的发展与商品化：起源于细胞计数自动化：1934年Moldavan首先报道了一种流动细胞自动计数装置。显微镜+稳定压力+毛细玻璃管1953年，Crosland-Taylor运用鞘液原理，设计了流动室，用快速流动的液柱包裹悬浮的轴流中的细胞、实现快速不拥堵的细胞计数，从而建立了流体动力聚焦原理。流式技术液流原理的基础。1959年，Coulter申请了“流动的悬浮粒子计数”专利，并据此生产出第一台血细胞计数器。根据Coulter原理，信号脉冲的幅度和宽度与细胞或颗粒的体积有关，从而区分不同大小的颗粒并计数。1965年，Kamentsky提出了用分光光度学定量测量细胞组分，不同组分同时测量实现了细胞分类。他是第一个用二维直方图显示流式参数和用计算机实现多参数分析的人。其测量速度可达500个/秒，还实现了仪器商品化(OrthoCytograph和Cytofluorograph)。9•流式细胞仪的发展与商品化：1967年，VanDilla和LosAlamos小组率先发展了一种液流束、照明光轴和检测系统光轴三者相互垂直的流式细胞计，运用了Crosland-Taylor的鞘流原理和氩离子激光器。后来又将Coulter计数器运用进去，研制出了现代意义上的流式细胞仪。他们首次实现了细胞中DNA定量分析，用直方图清楚显示了细胞周期中G1时相、S时相、和G2/M时相。1972年，LenHerzenberg等在斯坦福大学研制荧光激活细胞分选仪(FACS)，氩离子激光，标志着流式细胞仪商品化时代到来。10•流式细胞仪的发展及商品化1973年：BectonDikinson(BD)公司将其投入市场，第一台FACS-Ⅰ问世，其后20多年来不断改进完善产品，先后推出FACSAnalyzer、FACScan、FACSCalibur、FACSLSR-Ⅱ、FACSVantage、FACSDiva、FACSAria、FACSCanto等1975年：Coulter公司TPS-1问世，可做双参数分析，随后不断推出各种型号仪器，EPICS–C、EPICS-Profile、EPICS-ELITE等。1994年：美国Cytomation公司推出高性能、高速分选装置MoFlo，该机以出色的性能和创新设计理念，一经推出即受到广泛关注。2008年，美国BD公司推出Influx，在MoFlo基础上实现了原位、立体分选。其间仍不断有新的品牌型号推出市场，如德国Partec、密理博Guava、ABI等。2011年美国Stratedigm公司推出4激光18参数的S1000EX。11•流式细胞仪的分类临床型：临床检验资质SFDA认证。光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易掌握，适用于临床常规测试。科研型：分辨率高，选配多种波长和类型激光器，可将感兴趣细胞分选到特定容器或孔板上，适用于科研。1213Beckman公司的流式细胞分析仪GALLIOS（临床型）（临床型）医学部PekingUniversityHealthScienceCenter14BD公司的流式细胞分析仪FACSCalibur（临床型）LSRIIFACSCount（临床型）FACSCanto（临床型）15其他新型流式细胞分析仪BDAccuriC6BDFACSVerseStratedigmS1000EXGuavaeasyCyte6HT-2L医学部PekingUniversityHealthScienceCenter16DxFLEX（临床型）BDLSRFortessa其他新型流式分析仪纳米流式17A50Micro(Apogee)NanoFCM(厦大研发)流式细胞仪的结构与原理流式细胞术和流式细胞仪简介流式细胞仪的结构流式细胞仪的信号检测原理18流式细胞仪内部结构•光学系统激光光源光收集系统•液流系统流动室液流驱动系统•电子系统光电转换器数据处理系统•细胞分选系统喷嘴电偏转板样品收集器19医学部PekingUniversityHealthScienceCenter•光学系统激发光源»种类弧光灯：氙灯、高压汞灯：价廉，激发光谱广（优点）；单一谱线上能量弱、功率不稳定（局限性）激光器：气体激光器：氩离子（488nm）、氦氖(633nm）、氪离子（647nm)、氪氩（568nm）染料激光器：如氩离子激光泵浦的Rhodamin6G水溶液染料激光器，发出550-650nm可变波长激发光半导体激光器：价格低、结构简单、寿命长。如BD的FACSCalibur采用635nm半导体激光器20医学部PekingUniversityHealthScienceCenter»激光特点：相干光源、单波长、高能量、小发散角、高稳定性光照»目前主流产品标准配置：采用氩离子或氦氖激光器仪器选配2-4根激光：488nm、633nm、355nmUV或405nm»高端流式细胞仪：激光器可配到6根，波长多为488nm、633nm和355nmUV、405nm、444nm、561nm最多可同时检测18个参数（2个散射光参数，16个荧光参数）21医学部PekingUniversityHealthScienceCenter光学系统：光信号分离，导向222324医学部PekingUniversityHealthScienceCenter流式细胞仪的光学系统（单激光）25激光器SSC及荧光收集器流动室聚焦棱镜FSC收集器医学部PekingUniversityHealthScienceCenter26光收集系统：滤光片LongpassShortpassBandpass460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50医学部PekingUniversityHealthScienceCenter流式系统的三种滤光片27流式细胞仪内部结构•光学系统激光光源光收集系统•液流系统流动室液流驱动系统•电子系统光电转换器数据处理系统•细胞分选系统喷嘴电偏转板样品收集器28医学部PekingUniversityHealthScienceCenter•液流系统流动室：仪器核心部件，被测样品在此与激光相交液流驱动系统（压力泵）：空气泵+压力传感器29医学部PekingUniversityHealthScienceCenter流动室与液流驱动系统模拟图30医学部PekingUniversityHealthScienceCenter样本的流体聚焦31•入管道前，边缘与中心速度一致。•入管道后，受管壁粘性阻力边缘速度下降，中心速度不变•大约管道50倍直径处，稳定层流形成，产生流体聚焦效应•液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱。32液流速度通过样品压力来调节33医学部PekingUniversityHealthScienceCenter采样速度的影响检测速度影响样本流的直径大小。高速时样本流变宽，细胞间距缩短，单位时间内流经照射区细胞数增加。激光焦点处能量为正态分布，中心处能量最高，高速（Hi）时细胞可偏离中轴、不同位置细胞受激光照射能量不同，被激发的荧光强度也不同，造成测量误差。当检测分辨率要求高的实验应选择Low，如DNA分析。34流式细胞仪内部结构•光学系统激光光源光收集系统•液流系统流动室液流驱动系统•电子系统光电转换器数据处理系统•细胞分选系统喷嘴电偏转板样品收集器3536电子系统光电转换系统前置放大电路：输出脉冲信号光电转换器：将光信号转换为电信号。光电二极管：光灵敏度低，测定强信号（FSC）光电倍增管（PMT）：放大电信号,光灵敏度高，测定弱信号（SSC、FL1、FL2、FL3、…）模数转换电路：将模拟的峰值转换为数字信号数据处理系统：计算机系统数据采集、分析37（面积、峰高、宽度）38SSC信号FSC信号光二极管医学部PekingUniversityHealthScienceCenter光电信号转换39医学部PekingUniversityHealthScienceCenter电脉冲定量40医学部PekingUniversityHealthScienceCenter脉冲高度分析和数字转换41医学部PekingUniversityHealthScienceCenter流式细胞分析仪42医学部PekingUniversityHealthScienceCenter医学部PekingUniversityHealthScienceCenterBDFACSCalibur(双激光四色）43流式细胞仪的结构与原理流式细胞术和流式细胞仪简介流式细胞仪的结构流式细胞仪的信号检测原理4445流式细胞仪的信号检测原理•流式细胞仪检测信号的机理•常用的荧光染料及光谱交叉•如何选择荧光抗体•流式细胞仪检测信号的类型散射光信号：前向散射光FSC、侧向散射光SSC。与激光光源波长相同，通常是488nm。荧光信号：自发荧光、特异荧光FL。波长大于激光光源。46医学部PekingUniversityHealthScienceCenter流式细胞仪的光学系统（单激光）47激光器SSC及荧光收集器流动室聚焦棱镜FSC收集器散射光信号»FSC（小角散射光1~6°）与细胞大小有关。信号接收方向与激光照明光源一致。»SSC（90°角散射光）与细胞精细结构和颗粒性质有关，对胞膜、胞质、核膜变化更敏感。信号接收方向与激光照明方向垂直。48医学部PekingUniversityHealthScienceCenter外周全血细胞散射光双参数点图49荧光信号：激发及发射原理特点：荧光方向与SSC相同，与激光照明方向垂直，荧光波长比激发光波长要长（双色反射镜和带通滤光片将二者分开）。50医学部PekingUniversityHealthScienceCenter»当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过激光束时，染料吸收光子跃迁到高能级，返回基态时，染料释放出能量，大部分以光的形式释放。这种发射出的光称为荧光。51医学部PekingUniversit