流式细胞术基本原理及应用

流式细胞术原理及应用ForFCMTraining流式细胞术流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量流式细胞仪系统简介—通过流式细胞仪我们可以得到以下信息-相对细胞大小-相对细胞颗粒密度和内部复杂度-染色过细胞的相对荧光强度InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid流式细胞仪的光信号—散射光信号—荧光信号1.散射光信号•前向角散射光（FSC,ForwardScatter）入射激光的同向散射光信号细胞相对大小及其表面积。•侧向角散射（SSC,SideScatter）入射激光90角的散射光信号细胞粒度及细胞内相对复杂性。前向角散射光——FSC—ForwardAngleLightScatterFALSSensorLaser侧向角散射光——SSCFALSSensor90LSSensorLaser散射光—散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异-通常使用“散点图”来看散射光信号-散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据散点图——DotPlotlysedwholebloodReviewQuestionDeadcellsareknowntobesmallerandtoexhibitmoreinternalcomplexitythanlivecells.Whichofthepopulationsonthisplotwouldyouexpecttobedead?2.荧光信号荧光素吸收激光能量荧光素将吸收能量释放，转换为振动能和热能释放较入射光波长更长的光量子荧光素与特异抗体结合荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强荧光检测器FreqFluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(PMT3,PMT4etc.)Two-ColorCellAnalysisWhichofthethreepopulationshasthemostAbAbindingsites?AbAAbB双色荧光散点图现代流式细胞仪包括—液流系统聚焦细胞以供检测—光学系统激发和收集光信号—电子系统将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分析液流系统—液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处SampleFlowinOpticalCuvetteSampleLaminarFlowLowSampleFlowRate12mL/minSheathSheathSampleLaminarFlowSheathSheathOpticalCuvetteHighSampleFlowRate60mL/minReviewQuestionWhichofthefollowingwouldcausedisturbanceinthelaminarflowoftheopticalcuvette?A.bubblesB.cellularconcentrationC.sampleflowrateOpticsExcitationopticsconsistof:LasersLensesandmirrorsthatroutethelaserlighttothefluidicstreamCollectionopticsconsistof:FiltersthatdirectthesignalstotheappropriateopticaldetectorsOpticalFilters460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50LongpassShortpassBandpassFACSCalibur光路图OpticsLaserFluorochromesDetectorParameterFilterFITCGFPFL1530/30PEPIFL2585/42PerCPPerCP-CY5.5FL3670LPAPCFL4661/16488nm635nmElectronics—Convertsanalogsignalstoproportionaldigitalsignals—ComputesHeightforeachpulse—Calculateswidthandarea—InterfaceswiththecomputerfordatatransferCreationofaVoltagePulse-AnalogSignalLaserLaserLaserTimeVoltageTimeVoltageTimeVoltageQuantificationofaVoltagePulseTimeVoltsPulseAreaPulseHeightPulseWidth0—Heightisameasurementforallparameters.—Width=Area/HeightEffectoftheInstrumentControlsontheDataInstrumentControlsDetectorFSCdetector250gainFSCdetector350gainReviewDataProcessingFL2FL1SSCFSCFL4FL3ReviewQuestions1.WhichofthefollowingfluorochromescannotbeusedwiththeFACSCalibur?a.DAPI(ex.345nm,emits455nm)b.PropidiumIodide(ex.536nm,emits617nm)c.AlexaFluor647(ex.650nm,emits668nm)2.WhatarethethreemeasurementsofaparticlethatcanbedeterminedbyFACSCalibur?3.Brieflydescribethefunctionsofthefluidics,optics,andelectronicssystems.ReviewQuestions4.WhatwouldhappentothepopulationbelowifyouincreasedtheRedparametervalueintheInstrumentcontrols?ReviewQuestions5.Whichinstrumentcomponentsensurethatthefluorescencesignalofaspecificfluorochromeisonlymeasuredbyadesignateddetector?Forexample,APCisonlymeasuredbytheFL4detector.样本处理细胞悬液的制备—细胞悬液：–分离PBMC、PRP等：操作复杂，分离、离心步骤导致细胞特定群体丢失，并可能引入某些误差–直接使用外周血、骨髓：最接近生理状况，操作简便，样本用血量小–灌洗液、体腔积液–培养细胞、细胞系—实体组织：–病理组织：新鲜样本/石蜡包埋样本–针吸组织：新鲜样本—鞘液、洗液等：清洁无颗粒杂质步骤一：选择合适的荧光染料—必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发—激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内—荧光素光谱的重叠应当尽量减少荧光产生过程PropidiumIodide400nm500nm600nm700nmPIDNAExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nmFluorescein(FITC)400nm500nm600nm700nmWavelengthProteinExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nmExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nmPhycoerytherin(PE)ProteinAllophycocyanin(APC)Protein632.5nm(HeNe)ExcitationEmisson300nm400nm500nm600nm700nmFITC和PE荧光光谱补偿模型图步骤二：染色—体积—温度—孵育时间—对照直接染色—Fluorescentprobeattachedtoantibody—Specificsignal:weak—Nonspecificbinding:low间接染色—Fluorescentprobeattachedtoa2ndantibody—Specificsignal:strong,5-62ndAb/each1stAb;—Nonspecificbinding:highAvidin-BiotinmethodIbiotinylatedprimaryAbbiotinavidinbiotinylateddye示意图步骤三：数据收集和分析—画图—寻找目标细胞—调整仪器设置到合适的状态—我们可以得到怎样的结果？它们意味着什么？仪器设置调节1.用未染色细胞调整仪器PMT电压2.用单染色的细胞调节仪器补偿关于同型对照—例：一个双色染色的实验抗体AFITC，抗体BPE对应的同型对照是IgG1FITC,IgG1PE那么需要准备的是阴性对照：细胞加上IgG1FITC,IgG1PE单阳性对照：FITC:细胞加上AbAFITC,IgG1PEPE:细胞加上AbBPE,IgG1FITC数据分析—设门—设定阴性与阳性群体的界限—确定阳性与阴性细胞群体—统计阳性或阴性细胞群体的百分率，平均荧光值，绝对数或抗体结合数如何设定阴性与阳性的界限直方图散点图细胞结构细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量染色体分析细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体细胞凋亡在上述信号基础上的细胞分选流式细胞术的细胞学应用流式细胞仪的临床应用HIV免疫分型，CD4绝对计数白血病和淋巴瘤的免疫分型肿瘤的细胞周期和倍体分析网织红细胞计数细胞移植的交叉配型和免疫状态监测干细胞计数残量白血病细胞检查HLA-B27检查血小板功能及相关疾病流式细胞仪的科研应用免疫功能研究癌症病人的多药耐药性细胞动力学功能研究动物性别筛选海洋与环境微生物分析染色体分选流式细胞仪的遗传学应用细胞DNA,RNA含量的测定染色体倍体分析染色体分离基因表达产物的生物活性研究基因转染表达的生物效应基因表达调控研究细胞内基因定位酵母转基因株的筛选报告基因的定性定量检测植物遗传学研究••••••FlowCytometryinclinicsandresearchWhatcanFlowCytometertellusaboutacell?CellLineage/SubsetPhenotypeCytokine/ChemokineProductionRepertoireCytokine/ChemokineReceptorRepertoireMigration/HomingPhenotypreCellcyclestatus细胞增殖（细胞周期）—细胞内DNA含量—增殖相关基因的表达—BrdU的结合—示踪染料DNA探针DNA探针最主要的特点是，它们与DNA含量是成化学正比关系的——这样，带有的探针荧光分子的数目就和DNA分子的含量相当，从而检测DNA含量NucleicacidProbes菲啶基PropidiumIodideEthidiumBromide苯甲亚胺Hoechst33342抗生素Mithramycin,ChromamycinA3AcridineOrange-AOPyronynYG2MG0G1s02004006008001000G0G1sG2MDNAAnalysisDNAcontentCount2N4NNormalCellCycleAtypicalDNAHis