分子遗传学_遗传重组

Chapter5GeneticRecombination遗传重组Outline：1.什么叫遗传重组？2.遗传重组的类型3.同源重组的分子机制4.细菌的转化、接合和转导5.同源重组的酶学机制6.位点特异性重组7.转座8.插入序列、复合转座子9.转座的分子机制10.真核生物转座子Mutation突变个体基因突变基因间交流适者生存广义：任何造成基因型变化的基因交流过程都叫遗传重组(geneticrecombination)狭义：涉及DNA分子内断裂-复合的基因交流，有时又叫交换（crossingover）。DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为遗传重组(geneticrecombination)。重组产物为重组体DNA(recombinantDNA)。Section1遗传重组概述Outlineofgeneticrecombination•用于染色体上的基因作图（重组频率与基因之间的距离相关）•培育转基因细胞和生物重组原理的应用Geneticrecombination•HomologousRecombination同源重组•Site-specificRecombination位点特异性重组•TranspositionRecombination转座作用•IllegitimateRecombination异常重组------指发生在姐妹染色单体之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。------通常根据Holliday结构(hollidayjuncturestructure)的形成和拆分分为3个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holliday结构的拆分。Section2HomologousRecombination同源重组同源重组反应严格依赖DNA分子之间的同源性100%同源------HomologousRecombination100%同源------HemologousRecombination原核生物：通常放生在DNA复制过程中真核生物：常见于细胞周期的S期之后Homologousrecombinationoccursbetweenidenticalornearlyidenticalsequences.Itisalsocalledgeneralrecombination.同源重组需要满足的条件：（1）在交叉区域含有相同或几乎相同的碱基序列；（2）双链DNA分子之间发生互补配对；（3）需要重组酶的催化；（4）形成异源双链；（5）发生联会1.切断(nicking)2.链置换(stranddisplacement)3.单链侵入(single-strandinvasion)4.噜噗切除(loopcleavage)5.链同化(strandassimilation)6.异构化(isomerization)7.分支迁移(branchmigration)一、同源重组的分子机制（一）断裂-复合及Holliday中间体重组的前提之一是参与重组的两条DNA分子必须靠近，同源序列之间严格配对，配对又叫做联会(synapsis)。DNAinvading(recA)Branchmigration(recA)DNAligase5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holidayintermediate5´3´5´3´5´3´5´3´endonuclease(recBCD)endonuclease(recBCD)5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´Hollidayintermediate5´3´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´3´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´3´5´5´5´3´3´3´endonuclease(ruvC)endonuclease(ruvC)DNAligaseDNAligasepatchrecombinantsplicerecombinant电镜下的Holliday结构2012-3-1ThursdayChengduMedicalCollege18以上讨论的是两个完整的双螺旋DNA分子之间的重组。重组也可以发生在一个完整双螺旋DNA分子和一个片段（单链的和双链的）之间。（二）细菌转化、接合和转导的重组机制BacterialConjugationhasbeendefinedasthetransmissionofgeneticinformationfromadonorbacteriumtoarecipientcellthroughcell-to-cellcontact.（donor供体；recipient受体）§1Conjugation接合ConjugationprocessConjugationprocessConjugationprocessIntroductionofanexogenousDNAintoacell,causingthecelltoacquireanewphenotype.（exogenous外源的；phenotype形态）§2Transformation转化DNATransformationTransformationexperimentofStreptococcuspneumoniaeTransductionisthetransferofDNAfragmentsfromonebacteriumtoanotherbacteriumbyabacteriophage.（exogenous外源的；phenotype形态）§3Transduction转导Transduction1.E.coli的RecA蛋白是一个39kDa的单肽链，是同源重组过程中最重要的蛋白质，也叫重组酶(recombinase)2.作用：促进同源DNA联会和促进DNA分子间的单链交换二、同源重组的酶学机制①单链DNA结合活性②双链DNA结合活性③NTP酶活性④促进互补单链复性的能力RecA蛋白在同源重组的具体作用分为3个阶段：1.RecA的第一个DNA结合位点（初级位点）与单链DNA结合，包被DNA，形成蛋白质-DNA丝状复合物；2.RecA的第二个DNA结合位点（次级位点）与1个双链DNA分子结合，形成三链DNA中间体，随后单链DNA侵入双链DNA，寻找同源序列；3.RecA催化链交换，由被RecA包被的单链DNA从5′→3′方向取代双链DNA分子之中的同源旧链，形成异源双链，并发生分叉迁移RecA蛋白促进2个双链DNA分子链之间的交换RecA蛋白促进单链DNA与双链DNA进行链交换RecA蛋白单体的三维结构模型RecBCD蛋白：1.由RecB、RecC和RecD三个亚基组成。2.具有5种酶的活性——外切核酸酶V、解链酶、核酸内切酶、ATP酶和单链DNA外切酶；3.RecBCD蛋白参与细胞内的RecBCD同源重组途径——首先它与双链DNA分子自由末端结合，依靠其外切核酸酶V的活性同时降解DNA的2条链，然而，一旦遇到chi（χ）序列，RecD亚基就从复合物中释放出来，留下来的RecBC蛋白开始以解链酶的活性发挥作用，在水解ATP的同时，解开DNA双链，产生单链DNA，为RecA发挥作用铺平道路，最终起动了链交换和重组反应RecBCD蛋白的作用模型RecF途径：这主要是质粒之间进行重组的途径，需要的蛋白质有RecA、RecJ、RecN、RecO、RecQ和Ruv等Site-specificrecombinationoccursataspecificDNAsequence.位点特异性重组发生在两条DNA的特异位点上。ThefirstexamplewasfoundintheintegrationbetweenlDNAandE.coliDNA.Section3Site-specificRecombination位点特异性重组λDNAintegrationλ噬菌体的位点特异性整合TranspositionisthemovementofspecificpiecesofDNAinthegenome.转座过程中，转座成分从染色体的一个区段转移到另一个区段或从一条染色体转移到另一条染色体。由于转座作用总是伴随着转座成分的复制，故又称为复制重组(replicativerecombination)Section4Transposition转座作用Transpositionresemblessite-specificrecombinationbeingcatalyzedbyspecialenzymes.转座类似于位点特异性重组，只不过需要特殊酶的催化。可转移成分现在一般叫做转座单元，简称转座元（transposons），也叫做转座子。虽然“转移”，但是“复制”------转座作用涉及转座子的复制（replicativerecombination），当一个拷贝插入基因组的新位置后，原来位置上仍保留一个拷贝。和同源重组及位点特异性重组不同，转座作用不依赖转座子和靶点之间以及供点和靶点之间任何的序列同源性。§1细菌中的转座作用转座子插入复制使靶点处基因失活；存在及复制加重了细胞的生理负担基因缺失、倒位、易位；作为袖珍同源区域允许重组发生；某些细菌质粒进化的方式细菌中的转座成分依组成结构可以分为：插入序列(insertionsequences)、复合转座子(compositetransposons)、TnA转座子家族(TnAfamily)和可转移噬菌体(transposablephages)1.插入序列(insertionsequences)ISinsertionsequences(IS)including:invertedterminalrepeats(IR)：15~25bptransposasegenedirectrepeats：5~9bpISTranspositionTransposasegenetypesofIStransposition•duplicativetransposition•ConservativetranspositionduplicativetranspositionConservativetranspositionIS的转座机制IS的结构transposon•Insertionsequence+anothergene(usuallyantibioticgene)Transposasegenetet-RgeneTransposonsTransposition2.复合转座子(compositetransposons)复合转座子含有一个中心序列和位于其两侧的壁（IS或类IS）。中心序列含有抗药性基因等遗传信息。左、右两个壁在序列上相似，因此有时又叫长末端重复(lengthyterminalrepeat)。3.TnA转座子家族(TnAfamily)较长，约5000bp，比IS长的多。同时携带有负责自身转座的基因和诸如抗药性基因等其他基因。两端没有IS或类IS组件。4.可转移噬菌体(Muphages)以E.coli为寄主的温和噬菌体，以裂解生长和溶源生长两种交替方式之一繁衍自己。复合型转座子的结构Mu噬菌体的结构真核生物的转座子根据转座的机理将真核生物的转座子分为二类：第一类是反转座子，其转座过程是DNA→RNA→DNA，需要RNA中间体；第二类是DNA转座子，其转座过程是DNA→DNA，无RNA中间体。DNA转座子又分为复制型DNA转座子和保留型DNA转座子，其中，复制型在转位前后，原位置上的拷贝仍然存在，只是通过“复制”和“粘贴”的方式，复制一份到新的位点；而保留型在转座中，原来的拷贝被“剪切”后“粘贴”到新的位点，即原来的拷贝被原封不动地转移并保留到新的位点。每一类转座子都有自主型和非自主型。自主型转座子的内部含有开放的阅读框架，自己编码转座所必需的酶或蛋白质；非自主型转座子缺乏足够的编码能力，却