刘宁_DNA重组技术的基本工具

这就要用到定向改造生物的新技术——基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。原理：操作水平：结果：基因重组DNA分子水平定向地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的品种。基因工程：思考：为什么能把一种生物的基因“嫁接”到另一种生物上并成功表达？1、大多数生物的遗传物质都是DNA，且主要为双螺旋结构，即不同生物的DNA分子基本结构是相同的，都遵循碱基互补配对原则。所以不同的生物DNA可以嫁接2、地球上的所有生物共用一套遗传密码，所以，一种生物的基因可以在另外一种生物体内得以表达DNA重组技术的基本工具准确切割DNA的工具（“分子手术刀”）——限制性内切酶DNA片段的连接工具（“分子缝合针”）——DNA连接酶基因转移工具（“分子运输车”）——基因进入受体细胞的载体“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（简称限制酶）即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。特点：存在原核生物(主要是微生物)体内。专一性来源：作用：切断两个特定核苷酸之间的磷酸二酯键中轴线在G与A之间切割大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)只能识GAATTC序列，并在G和A之间切开。举例：黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。中轴线SmaI限制酶的作用在G与C之间切割平末端平末端SmaI限制酶的切割当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？寻根问底限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。DNA被限制酶切断后有两个反向互补的“黏性末端”。被同一种限制酶切断的几个DNA具有相同的黏性末端，能够通过互补进行配对。是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成重组的DNA分子了?基因的针线：DNA连接酶GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCG用同种限制酶切割２、基因的针线──DNA连接酶连接酶的作用是：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。15类型来源功能相同点差别E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体恢复磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)阅读课本第5页“分子缝合针”——DNA连接酶的相关内容，填写下表自主学习DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果用途都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质不需要需要形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制DNA连接酶与DNA聚合酶的比较只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键不同点：连接酶的作用是：将DNA片段间互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。DNA聚合酶和DNA连接酶有何相同和不同点？聚合酶：以一条DNA为模板，将一个一个核苷酸连接起来相同点：都是通过形成磷酸二酯键连接起来载体的作用载体的必要条件载体的种类阅读课本第6页“分子运输车”——运载体的相关内容，填写下表自主学习1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3）具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择。4）必须是安全的，对受体细胞无害。5）载体DNA分子应大小适中，以便于提取和操作1）作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中2）在受体细胞内对目的基因进行大量复制①细菌的质粒②病毒：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。有切割位点能复制并带着插入的目的基因一起复制质粒——裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体（即拟核DNA）之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。最常用运载体——质粒实际上在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。最常用的运载体——质粒分布：存在于许多细菌以及酵母菌等生物中。最常用的质粒是大肠杆菌的质粒。本质：细胞染色体(或拟核)外能自主复制的小型环状DNA分子。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内成。基因的运输工具——质粒能复制并带着插入的目的基因一起复制有切割位点有标记基因的存在，将来可用含青霉素的培养基鉴别。•作为运载体必须具备哪些条件？1.能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2.具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3.具有某些标记基因，便于进行筛选。如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。4.对受体细胞无害。基因工程的基本操作程序主要包括四个基本步骤：1）目的基因的获取2）基因表达载体的构建3）将目的基因导入受体细胞4）目的基因的检测与鉴定步骤一：目的基因的获取目的基因是人们所需要转移或改造的基因,获取目的基因是实施基因工程的第一步。如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。补：原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质编码区非编码区原核细胞的基因结构②有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。启动子补：真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子外显子能够编码蛋白质的序列叫做外显子不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游编码区下游内含子：外显子：真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。非编码序列：包括非编码区和内含子原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较思考编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码一、目的基因的获取1、目的基因主要是指______________________编码蛋白质的结构基因请举出三个以上的例子2、获取目的基因的常用方法有哪些?（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成请阅读P9第一和二两段(一)从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库基因文库基因组文库部分基因文库（如:cDNA文库）1.基因文库基因组文库与部分基因文库的关系怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?•目的基因的提取方法直接分离基因人工合成基因反转录法根据已知的氨基酸序列合成DNA：鸟枪法鸟枪法：供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶与载体连接载入受体细胞产生特定性状导入外源DNA扩增目的基因分离(直接分离法)1、直接分离基因1）反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA单链DNA(cDNA)双链DNA(即目的基因)反转录合成2.人工合成基因法2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成•上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点缺点鸟枪法反转录法根据已知氨基酸合成DNA法操作简便广泛使用工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因专一性强操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高专一性最强仅限于合成核苷酸对较少的简单基因思考:为什么要构建基因文库?直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗?•哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？1）DNA序列自动测序仪：2）PCR技术：对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术③条件：_______________________、_______________、___________(做启动子)、___________.前提条件：②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：选修1P60聚合酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增(二)利用PCR技术扩增目的基因1.用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。2.用_____________切断目的基因，使其产生_________________。(二)基因表达载体的构建——核心3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）——核心同一种(二)基因表达载体的构建4.过程:5.基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因它们有什么作用？•常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。•将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。步骤三：目的基因导入受体细胞(三)将目的基因导入受体细胞转化——方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1）农杆菌介绍（2）原理及适用范围(三)将目的基因导入受体细胞2、将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（2）程序：(三)将目的基因导入受体细胞3、将目的基因导入微生物细胞（1）思考：为什么选用微生物作为受体细胞？（2）方法：4、目的基因的检测和鉴定大量的受体细胞接受不多的目的基因。处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。无表达产物无表达产物有表达产物无表达产物(四)目的基因的检测与鉴定——检查是否成功检测—鉴定——①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交分子杂交（DNA-RNA杂交）抗原抗体杂交DNA分子杂交示意图采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个