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胰岛素类似物BKRA构建与表达2005级生命科学基地班杜鹃苗春晖李嫄王立军1、胰岛素的结构1.胰岛素是一条多肽，分子质量5734，由51个氨基酸组成。它含有A、B两条链，A链由21个氨基酸组成，B链由30个氨基酸组成，它们之间有两条二硫键A7-B6、A20-B19。此外，A链自身在6与11位有第三条二硫键2.用基因工程方法生产人胰岛素主要途径•一种是胰岛素原途径，即基因工程所生产的是胰岛素原或是其类似物，然后将胰岛素原或者其类似物体外转化为胰岛素。•另一种是A，B链重组途径，即用基因工程方法分别产生胰岛素A，B链，纯化的A，B链再经重组产生胰岛素。人胰岛素原类似物BKRA基因的合成•将BKRA基因分成6个片段合成，其中F1、F3、F5片段为正向链，F2、F4、F6片段为反向链（Fig.1）。将各基因片段按等摩尔数混合、退火：以Klenow片段完成中间补链和末端补平，获得含有限制性酶切位点的BKRA基因片段，全长182bp。BKRA片段基因结构GGGAATTCTATGTTCGTTAACCAGCACCTGTGTGGCTCTCACCCCTTAAGATACAAGCAATTGGTCGTGGACACACCGAGACTGCTCGTAGAAGCTCTGTACCTGGTTTGCGGTGAACGTGGCTTCGAGCATCTTCGAGACATGGACCAAACGCCACTTGCACCGAAGTTTTACACTCCGAAAACTAAGCGCGGTATCGTTGAACAGTGTAAAATGTGAGGCTTTTGATTCGCGCCATAGCAACTTGTCACATGCACCTCCATCTGCTCCCTTTACCAGCTGGAGAACTACTGTACGTGGAGGTAGACGAGGGAAATGGTCGACCTCTTGATGACAAACTGAAGCTTGGGTTGACTTCGAACCCEcoRI小C肽PvuIIHindIIIF1F2F3F4F5F6MKR终止B肽A肽人胰岛素原类似物BKRA基因的克隆•分别以EcoRⅠ-HindⅢ双酶切pUC18DNA和上述构建的BKRA基因片段（182bp），将载体DNA与BKRA片段（171bp）连接，获得重组质粒pUCⅠ。分别经EcoRⅠ-HindⅢ双酶切和PvuⅡ不完全酶切鉴定，均产生了与其大小的DNA片段。串联BKRA基因的构建•为了正确连接两个BKRA基因，在此设计了一个连接头接在前一个BKRA基因的末端，并构建了一个能与下一个BKRA基因5’端EcoRI粘端互补的序列。•然而由于接头是在PvuII平末端与前一个BKRA基因连接的，因此会切掉部分胰岛素A链基因，所以接头要补上相应的部分。串联BKRA基因的构建•为进行，合成了彼此互补的两个片段：•然后将磷酸化的F7与等摩尔的F8退火，中间接头形成：F7：CTGGAGAACTACTGTAACCGTCGC正向链F8：AATTGCGACGGTTACAGTAGTTCTCCAG反向链-CTGGAGAACTACTGTAACCGTCGC--GACCTCTTGATGACATTGGCAGCGTTAA-5’3’接头基因对比PvuII位点EcoRI位点串联BKRA基因的克隆•其5’端为PvuⅡ平端，3’端含有与EcoⅠ粘端互补的序列，但连接后不能再被EcoRI切割。然后共连接pKK223-3DNA的PvuⅡ-HindⅢ双酶切较大片段(2602bp)和BKRA基因片段(171bp)与上述接头，获得BKRA基因5’端带有接头的重组质粒pKILPHEPHpKK223-32806bppUCI4584bpEEEPPPPPHHHHE*E*EcoRIHindⅢPvuII+HindIIIPE*pUCI2806bp2797bp2886bppKILpUC18pUC2I2980bpEcoRIPvuIIPvuII不完全HindⅢEcoRIHindⅢ•用EcoRI-PvuII双酶切pUCIDNA，回收150bp片段•用PvuII-HindIII双酶切pKILDNA获得195片段•共连接pUC18DNAEcoRI-HindIII载体片段与上述150bp、195bp片段，获得含有串联BKRA基因(345bp)的重组质粒pUC2I。•分别经EcoRI-HindIII双酶切和PvuII不完全酶切鉴定，均产生了与其大小的DNA片段。核苷酸序列分析•将EcoRI-HindIII双酶切pUC2IDNA获得的串联BKRA基因片段(345bp)克隆于M13mp18获得重组噬菌体，按常规方法制备单链重组DNA。DNA序列分析表明，BKRA基因序列与预期的相符合，串联BKRA基因接头连接正确重组后BKRA片段基因结构GGGAATTCTATGTTCGTTAACCAGCACCTGTGTGGCTCTCACCCCTTAAGATACAAGCAATTGGTCGTGGACACACCGAGACTGCTCGTAGAAGCTCTGTACCTGGTTTGCGGTGAACGTGGCTTCGAGCATCTTCGAGACATGGACCAAACGCCACTTGCACCGAAGTTTTACACTCCGAAAACTAAGCGCGGTATCGTTGAACAGTGTAAAATGTGAGGCTTTTGATTCGCGCCATAGCAACTTGTCACATGCACCTCCATCTGCTCCCTTTACCAGCTGGAGAACTACTGTACGTGGAGGTAGACGAGGGAAATGGTCGACCTCTTGATGACAAACCGTCGCAATTCTATGTTCGTTTTGGCAGCGTTAAGATACAAGCAAEcoRI小C肽PvuIIF7F8接头NRRNSMMLysArgE*返回表达质粒的构建•以EcoRI完全酶切表达载体pET-28a(+)，用MungBean核酸酶切平末端，再经HindIII完全酶切，同回收载体片段；取pUC2I，同上完成EcoRI、Mungbean核酸酶和HindIII处理，同回收345bp串联BKRA基因片段，将pET-28a(+)重组表达质粒pET2I。经BamHI-HindIII双酶切，产生了预期的347bp片段；而经EcoRI-HindIII双切酶未产生任何插入片段，表明EcoRI位点消失。HHEEE*BPPEcoRIMungBeanHindIIIHE`B+HE`BE`H连接(E`)pET28a(+)5369bppUC2I2980bppET2I5691bp串联BKRA融合蛋白的表达和纯化•在IPTG诱导下，pET2I转化菌的表达产物为氨基酸末端含有六组氨基酸肽段的融合蛋白，其一级结构可简单表示为：•MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSAMBKRARRNSMBKRA•该蛋白全长147个氨基酸，推测分子量约为16.5kD，以包含体形式存在于细菌中。经SDS-PAGE分析，表明表达的融合蛋白的大小与预期的相符合。取表达菌经超声波裂解获得包含体，以PBSU溶液（20mmol/L磷酸盐缓冲液，PH7.4，0.5mol/LNaCl，8mol/L尿素）溶解包含体后，进行纯化。融合蛋白的后处理•用溴化氰裂解该融合蛋白，再经胰蛋白酶处理，断开碱性氨基酸Arg和Lys的羧基端，然而会误切掉B肽末端8个或1个氨基酸，然后再进行连接通过胰酶转肽的方法，接上相应片段的肽链，最终获得人胰岛素。三联体BKRA•在串联的BKRA基础上再连接一个BKRA这样可以增强表达效率，这与Shen发现的随着串联分子数增加，表达水平升高的结果相一致，如图：