肝癌动物模型建立的方法

·综摇摇述·肝癌动物模型建立的方法徐玉音，陈摇莉收稿日期：圆园员园原园远原员苑基金项目：南通市科技局应用研究项目（圆园园怨园远园）作者单位：南通大学医学院病理教研室，南通摇圆圆远园园员作者简介：徐玉音，女，在读硕士研究生。耘鄄皂葬蚤造：曾怎赠怎赠蚤灶圆苑岳赠葬澡燥燥援糟灶陈摇莉，女，教授，硕士生导师，通讯作者。耘鄄皂葬蚤造：遭造员岳灶贼怎援藻凿怎援糟灶摘要：肝细胞癌是一种常见的恶性肿瘤，尽管近年来采用分子生物学技术研究肝癌的发生，但仍缺乏对肝癌发病机制的确切认识。随着人们对肝癌动物模型研究的不断深入，逐渐建立了自发型、诱发性、移植性及转基因动物肝癌模型。因为这些模型很好地模拟了人类肝癌，可以用于肝癌的生理、细胞和分子等发病机制方面的研究，也可用于肝癌治疗药物的筛选以及基因治疗的探索。本文讨论一些有条件地、选择性诱导肝癌模型的情况，重点关注与人类肝癌关系最密切的肝癌动物模型，并对动物模型的临床应用进展进行简要介绍。关键词：肝肿瘤；动物模型；转基因；转基因动物中图分类号：砸苑猿缘郾苑；砸鄄猿猿摇摇文献标识码：粤文章编号：员园园员原苑猿怨怨（圆园员员）园圆原园源园缘原园缘摇摇人类疾病动物模型是指医学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物实验对象和相关材料，可分为自发瘤模型、诱发模型、移植模型和转基因动物模型等。实验动物模型与其模拟的人类肿瘤在分子、组织学以及生物学特性方面有许多共同性，可以用于肿瘤发病机制研究、肿瘤治疗药物的筛选以及肿瘤的基因治疗。本文对肝癌动物模型的建立及其临床应用进展予以综述，以供研究者根据各自研究的目的、实验室的条件等在建立合适的肝癌动物模型时参考。员摇自发性肝癌动物模型摇摇自发性肝癌动物模型是指实验动物未经任何有意识的人工处理，在自然状况下所发生的肝癌。实验动物多选用近交系小鼠，由于实验动物种属、品系的不同，肿瘤发生类型和发病率有很大差异。员源月龄以上的悦猿匀枣系雄鼠、悦猿匀系雄鼠和悦猿匀藻雄鼠的发生率分别为苑圆豫、愿缘豫和愿园豫［员］。摇摇该模型是完全在自然条件下发生的肝癌，排除了人为因素，肝癌的发生、发展与人类肝癌相似，反映了动物的肿瘤易感性和环境致癌物质、促癌物质的积聚程度。但该模型制备的成功率低且不稳定，制模时间较长，荷瘤动物个体在动物（性别、体重、肿瘤发生时间等）和肿瘤（大小、数目、部位等）两方面差异较大，预测参数参差不齐难于比较。该模型主要用于病理学研究和作为移植性肿瘤的瘤源。圆摇诱发性肝癌动物模型圆援员摇实验动物的选择摇选用敏感性高的纯系大鼠，常用品系有宰蚤泽贼葬则、杂责则葬择怎藻鄄阅葬憎造藻赠（杂阅）和云蚤泽糟澡藻则猿源源。大鼠的年龄和性别均对致癌的敏感性有影响，一般选用幼年大鼠，（猿耀源月龄以内）体重圆缘园早以下。新生员天的大鼠只要小剂量的二乙基亚硝胺（凿蚤藻贼澡赠造灶蚤贼则燥泽葬皂蚤灶藻，阅耘晕）即可使肝细胞癌变程序启动，而老年大鼠肝癌启动率低。对于性别和诱癌敏感性的关系尚有争议，一般认为雄性较雌性诱癌成功率高。晕葬噪葬贼葬灶蚤等［圆］在实验中发现雄性大鼠比雌性形成癌前增生性结节的数目多，摘除睾丸的大鼠明显减少肝癌的发生，提示雄性激素在大鼠实验性肝癌的发生、发展过程中起重要作用。圆援圆摇给药途径摇主要有经口给药法和注射给药法。经口给药法又分为自动口服给药和强制灌胃两种，前者是将水溶性致癌物溶于水中或将非水溶性致癌物混于饲料中让大鼠自动摄取，此法虽简便，但由于动物饮水和饲料的摄取量不同，不能保证准确药量；后者是将溶于水或悬浮于载体的诱癌剂通过特制的灌胃针头给大鼠灌胃，此法能准确掌握给药量，但强制性操作和定时给药会对大鼠造成一定程度的机械性损伤和心理上的影响。注射法也是一种常用的方法，可将诱癌剂溶于可溶性液体中或悬浮于载体中，通过各种部位注射给药，其中腹腔注射最常见，可根据诱癌剂的不同选择单次大剂量注射或多次小剂量注射。圆援猿摇不同诱癌剂的诱癌方法摇诱癌剂和诱癌方法很多，致癌化合物可单一应用也可联合应用。圆援猿援员摇二乙基亚硝胺（凿蚤藻贼澡赠造灶蚤贼则燥泽葬皂蚤灶藻，阅耘晕）诱发大鼠肝癌模型摇（员）用园郾圆缘豫阅耘晕水溶液按员园皂早辕噪早体重灌胃每周一次，其余时间园郾园圆缘豫阅耘晕水溶液由其自由饮用，约源个月可诱发出肝癌，缘耀远个月诱癌率达愿园豫以上；亦可用园郾园缘豫阅耘晕饮水喂养愿个月诱发肝癌。（圆）杂燥造贼鄄云葬则遭藻则诱癌模型的方法［猿］：实验第员天给大鼠腹腔一次性注射阅耘晕圆园园皂早辕噪早体重，圆周后开始喂含有园郾园圆豫的圆鄄乙酰氨基芴（圆鄄葬糟藻贼赠造葬皂蚤灶燥枣造怎燥则藻灶藻，圆鄄粤粤云）饲料圆周，在第猿周末做圆辕猿肝切除术，第源周末恢复标准饲料喂养，该方法诱癌快，在第源周大鼠肝内即可出现大量变异肝细胞灶。（猿）取体重圆园园早的雄性宰蚤泽贼葬则大鼠一次性腹腔注射阅耘晕（圆园园皂早辕噪早），然后给予园郾园缘豫的阅耘晕水溶液自由饮水，员圆周诱癌成功；（源）取体重圆园园早的雄性宰蚤泽贼葬则大鼠，给予阅耘晕水溶液（员园园皂早辕噪早）任其自由饮用，员远周诱癌成功；（缘）用成年雄性蕴耘宰辕杂杂晕大鼠，每天饮用含缘皂早辕噪早的阅耘晕水员愿周诱癌成功。·缘园源·临床与实验病理学杂志摇允悦造蚤灶耘曾责孕葬贼澡燥造摇圆园员员粤责则；圆苑（源）摇摇采用阅耘晕的传统诱癌实验均连续给药，易导致肝功能进行性不可逆性损伤。改良诱发肝癌的方法：在诱癌源周后，停饮含阅耘晕水而改饮灭菌自来水源周，使大鼠肝细胞损伤修复和代偿增生。在损伤修复中损伤阅晕粤误配修复和微卫星不稳定导致基因突变加剧，继而在阅耘晕诱癌过程中加速癌变，减少肝功能损伤而促进肝硬化及癌变。该试验至第员愿周末，诱癌成功率达员园园豫。造模过程中以低浓度阅耘晕通过自然饮水，诱发的大鼠肝癌接近自然过程，而且采用单一致癌剂，免受其他致癌因子的影响，有利于对病变的观察和分析［源］。圆援猿援圆摇黄曲霉素月员（粤枣造葬贼燥曾蚤灶月员，粤云月员）诱发大鼠肝癌摇诱癌方法：经口给药、注射、或灌胃给药。（员）最常用的是将粤云月员添加到饲料中定量食用，用含粤云月员源耀缘μ早饲料连续饲养大鼠远周，怨园天左右诱癌率达员园园豫。此法粤云月员用量大，最低剂量达园郾园园员耀园郾园园缘μ早辕天。（圆）用二甲基亚砜（凿蚤皂藻贼澡赠造泽怎造枣燥曾蚤凿藻阅酝杂韵）溶解粤云月员按每天源园园μ早辕噪早体重腹腔注射员次，连续圆周后停注粤云月员，改饲含园郾园员缘豫的圆鄄粤粤云饲料源周（实验第猿周实施肝大部分切除术）；或一次性注射园郾苑缘耀员郾缘皂早辕噪早体重的粤云月员，圆周后给予圆鄄粤粤云加肝大部分切除，由此建立粤云月员致大鼠肝癌的短期实验模型；（猿）圆豫的阅耘酝水溶液和园郾园园源豫的粤云月员阅酝杂韵溶液交替灌胃远周，联合诱发大鼠肝癌。该方法投药剂量小，给药时间短，癌灶形成较早；癌前病变的肝细胞增生以透明细胞灶多见，伴发肝硬化程度较阅耘晕诱发的肝硬化程度轻，形成时间较晚。此种方法与人体肿瘤发生病因学较为近似，故此类模型常用于肿瘤特点的研究。圆援猿援猿摇二甲基氨基偶氮苯（责鄄凿蚤皂藻贼澡赠造葬皂蚤灶燥葬扎燥遭藻灶扎藻灶藻，阅粤月）诱发大鼠肝癌模型摇（员）一般用含有园郾园远豫阅粤月的饲料喂养大鼠，同时控制维生素月圆的含量（不超过员郾缘耀圆皂早辕噪早体重），经源耀远个月可诱发出肝癌；（圆）化学药物猿鸳鄄甲基鄄源鄄二甲基氨基偶氮苯（猿忆鄄酝藻鄄阅粤月）诱导法建立杂阅大鼠肝癌模型，诱癌饲料用远豫的猿忆鄄酝藻鄄阅粤月花生油溶液按圆颐怨愿（灾辕宰）与精制大米充分混匀配成饲料，每天员园早分早晚圆次喂饲，猿个月诱发肝癌。圆援猿援源摇圆鄄乙酰氨基芴（圆鄄葬糟藻贼赠造葬皂蚤灶燥枣造怎燥则藻灶藻，圆鄄粤粤云）诱发大鼠肝癌模型摇诱癌方法：（员）以含有园郾园缘豫圆鄄粤粤云饲料喂养杂阅大鼠，猿周后即可出现癌前病变或癌变。镜下见肝细胞变性，卵圆形细胞增生，有大小不等的增生结节和癌巢结节形成。（圆）给成年大鼠含园郾园猿豫圆鄄粤粤云标准饲料，每只按圆耀猿皂早辕天的标准给予，猿耀源个月可诱发成功。此方法还可用于诱发小鼠、鸡、狗等动物的肝癌模型。圆援猿援缘摇亚胺基偶氮甲苯（燥鄄葬皂蚤灶燥葬扎燥贼燥造怎藻灶藻，韵粤粤栽）诱发小鼠肝癌模型摇诱癌方法：（员）用员豫韵粤粤栽苯溶液涂在动物的两肩胛间皮肤上圆耀猿滴，隔日员次，一般涂员园园次。给药后苑耀愿周即可出现肿瘤结节，苑个月以上可诱发小鼠肝肿瘤，诱癌率约缘缘豫。（圆）用圆郾缘皂早韵粤粤栽溶于葵瓜子油中，给悦猿匀小鼠皮下注射源次，每次间隔员园天，可诱发肝癌，肿瘤多为弥漫结节型。由于诱发因素和条件可以人为控制，诱发率远高于自然发生率，故在肝癌的研究中优于自发瘤形成模型。多用于肝癌病因学、发生学、发病机制、遗传学方面的研究。如应用阅耘晕诱发的大鼠肝癌，其在经历肝炎、肝硬化的基础上形成，与人肝癌的发生过程相似，对临床治疗将起到指导作用，也是较理想的适合影像学和分子生物学研究的动物模型。该模型的缺点是诱发过程中肝癌起病隐匿，建模周期长，常需猿耀缘个月，甚至员耀圆年，病死率高（缘猿郾愿圆豫）。肝癌出现的时间、部位、病灶数等在个体之间表现不均一。猿摇移植性肝癌动物模型摇摇移植性肝癌动物模型是指用肝癌组织或细胞（源于动物或人）移植到动物体内（肝脏、肝外组织或器官）或非肝脏来源的恶性肿瘤如乳腺癌等移植到动物的肝脏所形成的肝癌动物模型。人类肿瘤移植瘤的来源有肿瘤活检组织、手术切除标本、取自肿瘤患者的胸腹水内的肿瘤细胞和人类肿瘤细胞系。摇摇移植性肝癌动物模型主要用于筛选临床抗癌药。因使一群动物同时接种同样量的瘤组织和细胞，其瘤细胞生长速率比较一致，肿瘤的大小和位置较易控制，个体差异较小，接种成活率近员园园豫，对宿主的影响相类似，易于客观判断疗效，可在同种或同品系动物中连续移植，试验周期一般较短，试验条件易于控制。根据受体动物不同移植性肝癌模型可分为正常动物移植性肝癌模型和免疫缺陷动物移植性肝癌模型。前者受体动物多为小鼠和大鼠，后者受体动物多为裸鼠、裸大鼠。建立移植瘤的基本条件是：肿瘤标本的取材应在无菌条件下取新鲜、无坏死、无包膜的瘤组织，手术标本的取材应在员耀圆澡内完成，移植瘤受体动物（包括免疫缺陷动物）要求在源周龄左右。移植的最常用部位是背侧皮下［缘］，或移植于肝脏内、腹腔等部位。由于肿瘤生长在正常肝组织背景下，与人肝癌多发生在肝炎、肝硬化背景下有所不同。猿援员摇移植性大鼠肝癌模型摇采用宰葬造噪藻则鄄圆缘远肿瘤细胞株制备的大鼠原位移植肝癌大部分由肝动脉供血，而且该肿瘤呈膨胀性生长，类似于原发性肝癌的供血与生长方式，常作为肝癌诊断与介入治疗和酝砸陨检查的研究［远］。制作宰葬造噪藻则鄄圆缘远大鼠肝癌模型应注意以下问题［苑］：（员）严格无菌操作，努力将手术损伤降到最低，防止因感染影响大鼠的自然生存期。（圆）肝脏肿瘤种植部位选择在肝左外叶稍靠近肝边缘员耀圆糟皂处，可防止损伤大血管，避免增加止血难度和时间。种植完成后必须充分止血，防止大出血及瘤块被血流冲出肝脏而种植于腹腔。（猿）种植时尽可能选取大小一致的瘤块。（源）在进行酝砸陨检查时，大鼠需要充分麻醉，防止其在检查时移动体位。国内研究已经证实，将宰葬造噪藻则鄄圆缘远瘤株移植肝脏后，在瘤体直径小于猿皂皂时主要由门静脉供血，直径大于猿皂皂时主要由肝动脉供血，由于其血供特点和生长行为与人类肝癌相似，故该模型广泛应用于肝癌介入等治疗、影像学诊断及侵袭和转移等方面的研究。目前多采用瘤块肝包膜下移植制作该模型，也有人采用宰葬造噪藻则鄄圆缘远肉瘤细胞匀·远园源·临床与实验病理学杂志摇允悦造蚤灶耘曾责孕葬贼澡燥造摇圆园员员粤责则；圆苑（源）浆肝内注射建立大鼠移植型肝癌模型［愿，怨］。摇摇超声引导下瘤细胞肝内注射制备大鼠原位移植肝癌模型，其成瘤率不高，且易形成腹腔种植。现采用酝葬贼则蚤早藻造作为细胞支架制备大鼠肝癌模型可克服上述缺点，是一种较为理想的大鼠原位移植肝癌模型制备方法［员园］。酝葬贼则蚤早藻造是从耘匀杂小鼠肉瘤中制成的可溶性基膜成分，主要成分包括层粘连蛋白、胶原Ⅳ等，同时含多种细胞生长因子［员员，员圆］。在低温条件下，酝葬贼则蚤早藻造呈液态，注射到体内后酝葬贼则蚤早藻