第二章-微生物的分类鉴定

第二章微生物的分类鉴定与常见种类一、微生物分类鉴定步骤：①获得该微生物的纯种培养物②测定一系列必要的鉴定指标③查找权威性的鉴定手册不同种类微生物应采用不同的重点鉴定指标：真菌：形态特征较丰富、细胞体积较大，以形态特征为主要指标放线菌、酵母菌：形态特征与生理特征兼用细菌：形态特征较缺乏，使用较多的生理、生化和遗传等指标1.微生物的分类鉴定依据鉴于微生物形体微小、结构较简单等特点，微生物分类和鉴定除了像高等生物那样，采用传统的形态学、生理学和生态学特征之外，还必须寻找新的特征作为分类鉴定的依据。1.1经典分类鉴定依据1.1.1微生物的形态特征形态学特征始终被用作微生物分类和鉴定的重要依据之一，其中有两个重要原因：一是它易于观察和比较，尤其是在真核微生物和具有特殊形态结构的细菌中；二是许多形态学特征依赖于多基因的表达，具有相对的稳定性。①培养特征a.固体培养特征：菌落特征，大小、侧面隆起、光泽、粘稠、颜色、边缘、表面状况、质地、水溶性色素（粘质沙雷氏菌产红色或紫红色色素）等b.半固体培养特征：明胶液化、鞭毛运动情况c.液体培养特征：表面菌膜、混浊，底部沉淀各种微生物形成的菌落特征粘液型菌落菌膜菌沉淀均匀浑浊对照固体培养基液体培养基半固体培养基②细胞形态形态：球形、杆状、弧形、螺旋形、丝状、分枝及特殊形状大小：其中最重要的是细胞的宽度或直径排列：单个、成对、成链或其他特殊排列方式③特殊细胞结构有无鞭毛、芽孢、荚膜（糖被）、菌胶团孢子：形状、大小、颜色、着生位置、数量及排列细胞附属物：如柄、丝状物、鞘、异形胞等超微结构：壁、内膜系统、放线菌孢子表面特征等④细胞内合物硫粒、异染颗粒、伴孢晶体、PHB、气泡等⑤染色反应革兰氏染色、抗酸性染色抗酸性染色：分枝杆菌属或诺卡氏菌属的一些菌，普通方法染不上色，须加温或长时间染色，染色后的细胞用酸或碱处理不能脱色，把具此性质的细菌称为抗酸性细菌（含分枝菌酸，能与石炭酸和复红形成的复合物牢固结合，并能抵抗酸性酒精的脱色）。⑥运动性鞭毛泳动、滑行、螺旋体运动方式1.1.2微生物的生理生化特性生理生化特征与微生物的酶和调节蛋白质的本质和活性直接相关，酶及蛋白质都是基因产物，所以，对微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较，加上测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多，因此生理生化特征对于微生物的系统分类仍然是有意义的。在以实用为主要目的表型分类中，大量原核生物的属和种，仅仅根据形态学特征是难以区分和鉴别的，所以生理生化特征往往是这些医学上或其他应用领域中重要细菌分类鉴定的主要特征。（1）营养类型①光能无机自养型（光能自养型）②光能有机异养型（光能异养型）③化能无机自养型（化能自养型）④化能有机异养型（化能异养型）（2）对碳源的利用对各种单糖、双糖、多糖以及醇类、有机酸等的利用（3）对氮源的利用对蛋白质、蛋白胨、氨基酸、含氮无机盐、N2等的利用（4）对生长因子的需要对特殊维生素、氨基酸等的依赖性乳酸菌对生长因子的要求较高（5）对氧的要求好氧、微好氧、厌氧及兼性厌氧（6）对温度的适应性最低温、最适温、最高温、产物积累温度、致死温度（7）对PH的适应性在一定PH条件下的生长能力及生长的PH范围生长的PH范围：肠道细菌较宽；血液寄生微生物较窄，因循环系统PH一般稳定在7.3（8）对渗透压的适应性对盐浓度的耐受性或嗜盐性（9）对抗生素及抑菌剂的敏感性对抗生素、氰化钾(钠)、胆汁、石炭酸（系数）或某些染料的敏感性（10）代谢产物各种特征性代射产物如色素、有机酸、产气、硫代氢、明胶液化作用大肠菌群乳糖发酵，产酸、产气1.1.3微生物的生态特性在自然界的分布情况与宿主关系：共生、寄生、致病性等宿主种类有性生殖情况生活史，等1.1.4血清学试验与噬菌体分型（1）血清学试验细菌细胞和病毒等都含有蛋白质、脂蛋白、脂多糖等具有抗原性的物质，不同微生物抗原物质结构不同，赋予它们不同的抗原特征。常借助特异性的血清学反应来确定未知菌种、亚种或菌株。由于某些传染病与特定的血清型密切相关，其分布也有一定的区域性特征，所以血清型的划分在流行病的研究中有重要意义。通常是对全细胞或者细胞壁、鞭毛、荚膜或粘液层的抗原性进行分析比较。虽然血清学试验被广泛用于微生物分类鉴定的研究，但比较成功的应用是对种内（以及个别属内）不同菌株血清型的划分。例如，根据鞭毛抗原(H抗原)苏云金芽孢杆菌分成40多个血清型根据荚膜抗原肺炎链球菌分成近百个血清型根据菌体(O)抗原、H抗原和表面(Vi)抗原将沙门氏菌属细菌分成约2000个血清型大肠杆菌O-157（2）噬菌体分型在原核生物中已普遍发现有相应种类的噬菌体。噬菌体对宿主的感染和裂解作用常具有高度的特异性，即一种噬菌体往往只能感染和裂解某种细菌，甚至只裂解种内的某些菌株。所以，根据噬菌体的宿主范围可将细菌分为不同的噬菌型和利用噬菌体裂解作用的特异性进行细菌鉴定。这对于追溯传染病来源、流行病调查以及病原菌的检测鉴定有重要意义。例如，鼠疫耶尔森氏菌(Yersiniapestis)噬菌体已被用于对该菌的快速鉴定。在金黄色葡萄球菌引起的流行病的调查中，噬菌体分型也发挥了作用。此外，在工业生产中，噬菌体分型对防止噬菌体危害也有指导意义。1.2现代分类鉴定依据1.2.1细胞化学成分分析鉴定法根据不同细菌和放线菌细胞壁的肽聚糖分子结构和成分的差异，采用细胞壁成分分析法,对菌种分类鉴定有一定的作用放线菌全细胞水解液可分四类主要糖型,故采用全细胞水解液糖型分析法可进行初步分类鉴定位于细菌、放线菌细胞膜上的磷酸类脂成分,在不同属中有所不同,可用于分类鉴别；诺卡氏菌形放线菌所含枝菌酸的碳链长度有明显差别,故对枝菌酸的分析可用于属的分类。此外，气相色谱技术可分析微生物细胞和代谢产物中的脂肪酸类和醇类等成分,对厌氧菌等的鉴定很有用。1.2.2核酸的碱基组成和分子杂交与形态及生理生化特性的比较不同，对DNA的碱基组成的比较和进行核酸分子杂交是直接比较不同微生物之间基因组的差异，因此结果更加可信。比较DNA的碱基组成和进行核酸分子杂交，是目前通过直接比较基因组进行生物分类最常用的两种方法。（1）DNA的碱基组成(G+C)mol%DNA的碱基组成和排列顺序决定生物的遗传性状，所以DNA碱基组成是各种生物一个稳定的特征。分类学上，用G+C占全部碱基的摩尔百分比值（简称“GC比”）来表示各类生物的DNA碱基组成特征。亲缘关系近的生物，它们应该具有相似的GC比；若不同生物之间GC比差别大表明它们关系远。但具有相似GC比的生物并不一定表明它们之间具有近的亲缘关系，因为核苷酸序列可差别很大高等植物的GC比范围大约为35-50%；脊椎动物GC比约为35～45%之间；而原核生物中GC比变化幅度宽达22～80%，这也足以表明原核生物是一个极为多样性的类群。同一个种内的不同菌株GC比差别应在4～5%以下（差别＞5%肯定不是同一个种）(＜2%无意义，因测定方法本身的误差可能高达2%)同属不同种的差别应低于10～15%，通常低于10%（差别＞15%肯定不是同一个属）是发表任何微生物新种时必须具有的重要指标在疑难菌株鉴定、新种命名、建立一个新的分类单位时，G+C含量是一项重要的、必不可少的鉴定指标。其分类学意义主要是作为建立新分类单元的一项基本特征和把那些GC比差别大的种类排除出某一分类单元。测定DNA碱基组成的方法：由于热变性温度法操作简单、重复性好而最为常用。基本原理：将DNA加热，两条单链逐渐被打开，从而使DNA溶液260nm紫外吸收明显增加，称DNA的增色效应。G+C％增加，所需温度也较高，当温度高达一定值时，DNA完全分离成单链，此后紫外吸收不再增加。DNA的热变性过程(即增色效应的出现)是在一个狭窄的温度范围内发生的，紫外吸收增加的中点值所对应的温度称为该DNA的热变性温度(Tm)。在一定条件下，DNA的Tm值与DNA的G+Cmol%成正比。Tm＝69.3＋0.41（G+Cmol）％（2）核酸的分子杂交①DNA-DNA杂交基本原理：双链DNA分子加热可变性，冷却处理时，又可复性。不仅同一菌株的DNA单链可以复性结合成双链，来自不同菌株的DNA单链，只要二者具有同源互补的碱基序列，它们也会在同源序列之间互补结合形成双链，这就称之为DNA-DNA分子杂交。不同微生物之间，DNA同源程度越高，其杂交率就越高，若两个菌株DNA分子序列完全相同，则应100%地杂交结合。具体测定方法很多，按杂交反应的环境可分为液相杂交和固相杂交两大类。在这些方法中，有的需要用同位素标记DNA，有的则用非同位素标记，而复性速率法则是通过测定单链DNA分子复性结合的速率来计算DNA的同源性而不需要对DNA分子进行标记。细菌常用固相杂交法：（参照菌株）A菌B菌（待测）↓↓DNADNA↓↓（同位素标记、酶切并解链）单链单链（固定于滤膜上，未标记）↓最适温度复性杂交↓洗涤↓测定放射强度↓杂交率（以参照菌株自身复性的放射性值为百分之百）﹥60%同一个种；﹥70%同一亚种；20～60%同属不同种对于许多有争议的种的界定和建立新种起了重要作用②DNA-rRNA杂交rRNA是DNA转录的产物，在生物进化过程中，其碱基序列的变化比基因组要慢得多，保守得多，它甚至保留了古老祖先的一些碱基序列。因此，当两个菌株的DNA-DNA杂交率很低或不能杂交时，用DNA-rRNA杂交仍可能出现较高的杂交率，因而可以用来进一步比较关系更远的菌株之间的关系，进行属和属以上等级分类单元的分类。DNA-DNA杂交和DNA-rRNA杂交的原理和方法基本相同，只是在技术细节上有些差异，如DNA-rRNA杂交中，用同位素标记的是rRNA而不是DNA等等。③核酸探针广泛用于微生物鉴定、传染病诊断、流行病调查、食品卫生微生物检测以及分子生物学许多领域。所谓核酸探针(probe)是指能识别特异核苷酸序列的、带标记的一段单链DNA或RNA分子。因此，一种核苷酸片断能否作为探针用于微生物鉴定，最根本的条件是它的特异性，即它能与所检测的微生物的核酸杂交而不能与其他微生物的核酸杂交。根据特异性的不同，在微生物鉴定与检测中的作用也不同，有的探针只用于某一菌型的检测，有的可能用于某一种、属、科甚至更大类群范围的微生物的检测或鉴定。例如，从一株淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)隐蔽性质粒制备的DNA探针，它具有种的特异性，可用来检测和鉴定这种引起人类性行为传播疾病的细菌。使用核酸探针来鉴定或检测微生物的方法，是将探针与所检测的细菌进行杂交。在细菌鉴定或检测临床标本中的细菌时，常用菌落原位杂交法，大致步骤是：将细菌点种于硝酸纤维素膜上进行培养；加溶菌剂使细胞释放出DNA分子；加变性剂使DNA离解成单链并固定于膜上；加入带标记的核酸探针进行杂交；洗膜后进行显色或显影鉴定。用核酸探针来鉴定或检测微生物，具有准确、快速等优点，特别是当用常规方法难于鉴定和检测时，往往更显示其优越性。1.2.3微生物全基因组序列DNA是除少数RNA病毒以外的一切微生物的遗传信息载体。每一种微生物都有其自身独特而稳定的基因组DNA序列，不同菌种间基因组序列的差异程度，代表着它们之间亲缘关系的疏密。对那些与人类健康、生活和生产关系重大的微生物，进行全基因组DNA序列测定，是当前生物科学领域中掌握某微生物全部遗传信息的最佳途径，也是微生物现代分类鉴定中更细致和更精确的遗传性状指标。1.2.4遗传重组大多数真核生物都能进行有性生殖，所以分类学上用能否进行有性生殖来定义物种。原核生物中，虽然没有有性生殖，但它们可以通过转化、转导和接合作用进行染色体基因的交换，这种交换通常具有种属特异性。研究表明：发生接合、转化和普遍性转导的细菌之间需要存在广泛的染色体同源性，否则此类重组(