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PCR定义PCR（PolymeraseChainReaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。PCR技术的基本原理一、PCR反应成分：1.模板DNA；2.引物；3.四种脱氧核糖核苷酸；4.DNA聚合酶；5.反应缓冲液、Mg2+等。二、PCR扩增过程1、高温变性(denaturation)在高温条件下，使DNA双螺旋的氢键断裂，双链DNA变成单链DNA变性温度：94-97℃，30-50s2、低温退火(annealling)当温度降低时，由于模板分子的结构较引物复杂，且反应体系中引物的量大大多于模板DNA，使引物与其互补的模板在局部形成杂交链。退火温度：25-60℃，常55℃60-90s，常60s3、适温延伸(extension)在DNA聚合酶、dNTPs、Mg2存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。延伸温度：70-74℃，常72℃60-120s以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。PCR反应体系中的各组分分析一、引物(primer)引物的设计决定PCR反应的成败PCR的效率和特异性取决于：1、引物与模板的特异结合2、聚合酶对引物的有效延伸引物设计原则1、引物长度以16-30bp为宜引物过短，特异性降低引物过长，成本增加，PCR的最适延伸温度会超过TaqDNApol的最适温度若引物长8bp，则平均每隔48=65536bp就有一个结合位点。人大约有43000个可能的结合位点若引物长16bp，则平均每隔416=4.29×109bp有一个结合位点。2、引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段3、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜4、碱基分布的随机性：ATGC随机分布，避免5个以上的相同碱基成串排列。尤其是引物的3‘端，不应有连续3个G或C5、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。6、两引物之间不互补，一对引物之间不应多于4个连续碱基有互补性，以免产生引物二聚体7、引物3‘端是引发延伸的点，不应错配：由于ATGC引起错配有一定规律，以引物3’端A影响最大，因此，3‘端的末位碱基最好选TCG，而不选A。8、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源9、引物5‘端可以修饰加酶切位点；用生物素、荧光物质、地高辛等标记；引入突变位点；引入启动子序列；引入蛋白质结合序列5‘端修饰后不影响正常的PCR反应引物的保存和使用浓度冻干，-20℃，可保存1年，常保存6月使用最终浓度：0.2-1.0μmol/L，适宜小于0.2μmol/L，影响产量大于1.0μmol/L，不经济，出现非特异性扩增产物和引物二聚体二、Mg2+浓度终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP为200μmol/L，注意Mg2与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2，当dNTP浓度达到1mmol/L时会抑制Taq酶的活性。Mg2能影响反应的特异性和产率。三、BSA一般用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用。四、底物（dNTPs）dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.0～7.5，一般存储浓度为10mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20～200μmol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。五、Taq酶能耐95℃高温而不失活，其最适pH值为8.3～8.5，最适温度为75～80℃，一般用72℃。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性，没有校正功能。某种dNTP或Mg2浓度过高,会增加其错配率。用量一般为0.5～5个单位/100μl。六、模板PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。七、无Mg2buffer由纯水、kcl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。kcl可降低退火温度，但不能超过50mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。PCR反应条件的选择（影响因素）温度参数：1.变性：模板变性完全与否是PCR成功的关键，一般先于94℃（或95℃）变性3～10min，接着94℃变性30～60s。2.退火：退火温度一般低于引物本身变性温度5℃。引物长度在15～25bp可通过公Tm=(G+C)×4℃(A+T)×2℃计算退火温度，一般退火温度在40～60℃之间，时间为30～45s。如果(GC)低于50%，退火温度应低于55℃。较高的退火温度可提高反应的特异性3.延伸：延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内，一般在70～75℃。延伸时间要根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常对于1kb以内的片段1min是够用的。循环数：PCR的循环数：主要由模板DNA的量决定，一般20～30次循环数较合适，过多的循环数会增加非特异扩增产物，具体要多少循环数可通过预试验确定。PCR产物积累规律：反应初期产物以2n呈指数形式增加，至一定的循环数后，引物、模板、DNA聚合酶形成一种平衡，产物进入一个缓慢增长时期（“停滞效应”），即“平台期”。到达平台期所需PCR循环数与模板量、PCR扩增效率、聚合酶种类、非特异产物竟争有关PCR常见问题一、PCR污染与对策污染原因：标本间交叉污染PCR试剂的污染PCR扩增产物污染实验室中克隆质粒的污染污染防治：1.戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；2.使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；3.避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；4.操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；5.最后加入反应模板，加入后盖紧反应管；6.操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性；7.尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；8.重复实验，验证结果，慎下结论。二.假阳性结果的预防1、实验器材应一次性使用(吸咀、PCR管)2、注意操作环境，戴一次性手套3、严格PCR操作规程4、多次取样的试剂应分装5、设置阴性对照和阳性对照三.非特异产物及电泳呈涂布状1.Mg2浓度调节2.调整引物、模板、聚合酶的用量3.适当减少循环数4.适当提高退火温度，缩短退火或延伸时间