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浙江大学生物系统工程与食品科学学院博士学位论文同源重组技术构建蛋白酶A低表达且能产β-葡聚糖酶的酿酒酵母菌株及其性能研究姓名：张强申请学位级别：博士专业：食品科学指导教师：何国庆20080401同源重组技术构建蛋白酶A低表达且能产β-葡聚糖酶的酿酒酵母菌株及其性能研究作者：张强学位授予单位：浙江大学生物系统工程与食品科学学院相似文献(2条)1.学位论文张洪波采用同源重组技术构建PrA低表达且能分泌LTP1的酿酒酵母菌株及其性能研究2009酿酒酵母蛋白酶A(PrA)〔EC3.4.23.25〕为酿酒酵母产生的一种酸性蛋白水解酶。纯生啤酒采用低温膜过滤除菌达到生物稳定性，因而蛋白酶A的活性不被破坏。由于啤酒的pH值在4.3—4.4的酸性范围内，因此啤酒被消费者消费之前，蛋白酶A都会降解啤酒中的蛋白和多肽，尤其是当啤酒中的泡沫阳性蛋白被蛋白酶A降解后会导致啤酒的泡沫衰减、泡持性降低。啤酒的泡沫性能是用来衡量啤酒质量的一个重要指标。前人的研究结果证实啤酒中的大麦脂转移蛋白1(LTP1)是对啤酒泡沫稳定性最为关键的蛋白，这种蛋白是底物特异性较小的酵母蛋白酶A的作用底物，这使得纯生啤酒的泡沫衰减问题更加突出。br 为从根本上解决纯生啤酒的泡沫衰减问题，本研究论文中从酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)基因组中通过PCR分别扩增得到了酿酒酵母乙醇脱氢酶启动子(ADH1promoter)、MFα1信号肽序列(MFα1s)、细胞色素C终止子序列(CYC1terminator)等表达调控DNA序列；从二棱大麦(Hordeumvulgare)基因组中扩增得到了大麦脂转移蛋白1(LTP1)的编码序列，并构建了酿酒酵母的大麦脂转移蛋白1的表达盒。将遗传霉素G418的抗性序列KanMX作为筛选标记与大麦Ltp1表达盒共同克隆到质粒YEplac181的多克隆位点中，得到酿酒酵母大麦LTP1分泌表达型质粒YEp181—KAMLC。使用质粒YEp181—KAMLC对酿酒酵母WZ65进行转化并使用酿酒酵母转化子菌株进行发酵实验，采用HPLC对大麦Ltp1表达盒的下游产物进行检测。检测结果表明，大麦脂转移蛋白1在酿酒酵母菌株WZ65中得到了分泌表达，在发酵开始的24小时内大麦脂转移蛋白1的产量增加较为缓慢，之后有较大的提高，72小时后大麦脂转移蛋白1分泌量的增加速度变慢。随着发酵时间的延长，大麦LTP1的产量一直呈现上升趋势。到发酵的132小时，发酵液中大麦脂转移蛋白1的分泌量达到29.45mg/L。br 使用含有大麦Ltp1表达盒和KanMX标记序列的转化DNA片段同源重组到酿酒酵母基因组上PEP4基因位点，使一个PEP4等位基因的编码序列被外源基因序列所替换。这样将会使酿酒酵母在表达啤酒泡沫阳性蛋白—大麦LTP1的同时，由于PEP4一个等位基因的缺失而造成其编码产物—蛋白酶A表达的降低，从而达到既增加泡沫阳性蛋白LTP1的含量，又有效降低其被蛋白酶A的降解作用。通过对转化子的筛选和鉴定，得到了基因型为PEP4/pep4：：KanMX—Ltp1的酿酒酵母重组子菌株。对得到的重组菌株进行发酵培养，通过采用变性不连续SDS—PAGE和Tricine—SDS—PAGE方法对经过处理的发酵液进行分析发现，本实验中所用到的对酿酒酵母重组菌分泌到培养液的大麦LTP1两种电泳分析方法中，Tricine—SDS—PAGE方法要比普通的SDS—PAGE方法优越。酵母表达的分子量大小约10KDa的蛋白条带能够得到很好的分离。进一步免疫印迹实验证实，重组菌株分泌的分子量对应于10KDa左右的表达产物为大麦LTP1。br 为了确保重组菌株在工业生产中的安全性，需要对抗性选择标记KanMX进行删除。TEF1启动子不能被本实验中所用的酿酒酵母表达系统所识别，因此使用TEFpromoter更换了Shble表达盒中的TEF1promoter，并构建了质粒pSH47/ZEO，利用Cre/loxP系统对重组子染色体上的KanMX进行了删除，并成功的使酵母细胞丢掉了质粒pSH47/ZEO。最终获得了大麦Ltp1表达盒结构完整、整合位点精确的酿酒酵母重组菌株。br 对不同发酵时期LXP1的浓度检测结果表明，在12°P未加酒花的麦汁中重组菌株S．c—Ltp1α和S．c—Ltp1β在发酵第108小时分泌大麦LXP1的浓度分别达到18.76和18.28mg/L；在8°P添加酒花的麦汁中重组菌株S．c—Ltp1α和S．c—Ltp1β在发酵第108小时分泌大麦LTP1的浓度分别达到12.07和12.13mg/L。对获得的重组菌株S．c—Ltp1α和S．c—Ltp1β进行继代培养并对其遗传稳定性、生长性能、发酵力、絮凝性和蛋白酶A活性等生理生化指标进行了测试。重组菌株经过继代培养30代后遗传性能稳定。重组菌株与出发菌株相比，蛋白酶A活性降低了30％左右，对数生长期变慢，但稳定期的细胞浓度与对照菌基本相当，其他生理指标与对照菌株无明显差异。br 通过酿酒试验对多项指标的测试结果表明，重组菌株酿造的啤酒口味与现行其他干啤相近，各项理化指标均达到国家标准优级，泡持时间从原来的202s提高到326s。2.学位论文刘波工业酿酒酵母菌株met10基因敲除及其用于工业生产可行性的研究2005本研究采用LFH-PCR法从质粒pFA6a-kanMX4及酿酒酵母染色体上构建了两端带有酿酒酵母met10基因同源序列的具有G418抗性的外源基因片段。利用完整细胞转化法将构建的外源基因片段导入工业酿酒酵母细胞内，外源基因片段通过同源重组而整合于酿酒酵母染色体，破坏酿酒酵母met10基因从而得到met10基因敲除菌株。通过1吨发酵罐发酵试验，比较了met10基因敲除菌株和原始酿酒酵母工业菌株的生长性状、发酵性能及啤酒中乙醛、酯、高级醇及亚硫酸盐等成份的含量，发现met10基因敲除菌株较原始菌株生长快、发酵度高、发酵周期短；啤酒中游离亚硫酸盐含量并未明显提高但啤酒中乙醛等醛类物质含量有较大程度的降低，从而提高了啤酒风味的稳定性；met10基因敲除菌株对于发酵液中的双乙酰还原能力较原始菌株差。通过100吨啤酒发酵罐发酵啤酒及贮存试验表明，met10基因敲除菌株酿造的啤酒比外加亚硫酸盐的啤酒口感更好，贮存时间也较长。本文链接：授权使用：上海海事大学(wflshyxy)，授权号：e21d6577-af0c-443b-b2c4-9e17008f80a5下载时间：2010年10月22日