同源重组（PPT95页)

DNA分子的断裂和重新连接导致遗传信息的重新组合，称为重组（recombination）。重组的产物称为重组DNA（recombinantDNA），所有的DNA都是重组DNA。由于重组，一个DNA分子的遗传信息可以和另一个DNA分子的遗传信息结合在一起，也可以改变一条DNA分子上遗传信息的排列方式。DNA重组广泛存在于各类生物中，说明重组对物种生存具有重要意义。通过重组实现基因的重新组合使物种能够更快地适应环境，加快进化的过程。此外，DNA重组还参与许多重要的生物学过程，比如重组在DNA损伤修复和突变中发挥重要作用。第一节：重组DNA重组包括同源重组（homologousrecombination）和位点特异性重组（site-specificrecombination）。同源重组是更为普遍的一种重组机制，它可以发生在任何两种具有相同或相似序列之间，涉及到两个DNA分子在相同区域的断裂和重新连接。位点特异性重组发生在DNA分子特定的序列之间，需要特异性的蛋白质识别并催化特异序列之间的重组。位点特异性重组发生的几率相对较小。一、同源重组（homologousrecombination）同源重组（homologousrecombination）发生在两个同源DNA分子之间。真核细胞减数分裂过程中，同源染色体彼此配对，同源染色体DNA片段发生交叉与互换。这是发生在真核生物中的同源重组。同源重组在接合、转导或转化后外源DNA整合到细菌基因组中。RobinHolliday提出的遗传重组模型是人们从分子水平上认识重组的基础。FirstMeioticInterphase(cellscontain4NDNAcontent)Bivalentsisterchromatidsalignwitheachother,thisactistermedsynapsis.Synapsedsisterchromatidsaretermedasynaptonemalcomplex)Figure5-55,page185两条同源DNA分子彼此并排对齐，相互配对DNA中两个方向相同的单链在DNA内切酶的作用下,在相同位置上同时切开。在切口处发生链的交换，形成所谓的连接分子（jointmolecule），也称Holliday结构（Hollidaystructure）。分支点可以发生移动，称为分支迁移（branchmigration），分支迁移的结果是在两个DNA分子中形成异源双链区（heteroduplex）。1.Hollidaymodel链交换所形成的连接分子必须进行拆分，才能形成两个独立的双链分子。这需要再产生两个切口。反应结果要看切开的是哪一对链，如果切口发生在当初未切的两条链上，那么原来的4个链就全被切开，就会释放出剪接重组DNA(splicerecombinantDNA)分子。如果切口发生在当初被切的两条链上，连接分子拆分后将形成补丁重组体（patchrecombinant）。分开的两个DNA分子除保留了一段异源双链DNA外，均完整无缺。因此，连接DNA分子无论如何拆分，所形成的两个独立的DNA分子总有一段异源双链区，但是异源双链区两侧的重组未必同时发生。SynapsedchromatidsRecombinationjointHeteroduplexDNAABB’A’ABA’B’ABB’A’HollidayintermediatesABB’A’ABA’B’AB’A’BEndonucleasesaka.resolvases(e.g.RuvC)ProductsbeforeDNArepairHollidayIntermediate(seePhotoinLehningerpg962)Termed“patchrecombinants”2.Meselson-RaddingMatthewMeselson和CharlesRadding对Holliday模型进行了修改。Holliday模型要求在两个并排对齐的同源DNA分子的对应位点形成单链切口，从而产生游离的单链末端。然而，在Meselson-Radding遗传重组模型中，仅在一个双螺旋上产生单链切口。利用切口处3’-OH合成的新链把原有的链逐步置换出来，使之成为以5’－P为末端的单链区。随后游离的DNA单链侵入另一条DNA双螺旋中，取代它的同源单链并与其互补链配对形成异源双链区，被置换的单链形成D－环（D-loop）。D－环单链区随后被切除,两个DNA分子在DNA连接酶的作用下形成Holliday交叉。与Holliday不同，此时只在一条DNA分子上出现异源双链区。如果发生分支迁移，在两条双螺旋上均出现异源双链区。随后发生的连接分子的拆解与Holliday模型一样。3.重组的双链断裂模型DNA双链断裂（double-standbreak,DSB）也会引发同源重组。根据该模型，重组时两个彼此配对的DNA分子的中的一个发生双链断裂，而另一个保持完整。双链断裂后，在核酸外切酶的作用下，切口被扩大，并且形成2个3’单链末端。其中一个单链末端侵入未打开的双螺旋的同源区，并取代其中的一条链，形成D环。随着侵入链被DNA聚合酶延伸，D环不断扩大，当D环的长度超过断裂DNA分子上被降解的区域，断裂DNA分子的另一3’单链末端就与D环的单链区退火，并作为引物被DNA聚合酶延伸。结果，断裂受体DNA分子上被降解的区域就以另一DNA分子上的同源区为模板得到了修复，同时形成两个分支点，分支点会沿着DNA移动，发生分支迁移。最终Holliday结构被拆分，形成两个独立的DNA分子，从而结束重组事件。同样地，依据拆分Holliday结构时所剪切的DNA链，可以最终决定DNA分子重组位点两侧的基因是否发生交换。Holliday中间体是否真的存在？从细菌和动物细胞中可以分离出正在发生重组的质粒和病毒DNA。从它们的电镜照片上，我们可以发现与Holliday中间体类似的交叉和围绕着交叉点旋转形成的Holliday异构体。因此，无论重组的起始机制是什么，两个相连的DNA分子之间的交叉点都要发生迁移，并且Holliday结构要围绕交叉点发生旋转形成异构体。4.大肠杆菌的遗传重组通过遗传分析，在大肠杆菌细胞中已经发现了3种重组途径，即RecBCD、RecE、RecF途径。以下步骤为这3种途径所共有：（1）产生一个具有3’－OH末端的单链DNA片段；（2）单链DNA侵入其同源双链DNA分子；（3）形成Holliday中间体，并发生分支迁移；（4）内切核酸酶对中间体进行切割，连接后产生重组体；（5）三种重组途径均需要RecA蛋白。与Meselson-Radding模型一样，细菌中的重组也是由单链切口发动的。然而，在大肠杆菌中引发重组的单链末端是3’-OH末端，而不是5’-P末端。在这里我们主要介绍由RecBCD酶复合体发动的重组途径，这也是大肠杆菌中最重要的重组途径。RecBCD具有多种酶活性，其主要的酶活性包括：ssDNA外切酶活性、dsDNA外切酶活性和解旋酶活性。解旋酶能够在SSB存在情况下使双链DNA解螺旋。RecBCD与dsDNA的末端结合，然后以大约每秒1000bp的速度解开DNA双链，同时降解解旋产生的ssDNA。RecBCD对两条单链的降解速度是不一致的，它优先降解3’末端链。一个正在被RecBCD加工的DNA的末端会形成一个单链环和一个5’端拖尾。RecBCD的酶活性受重组热点Chi的调节。Chi位点大肠杆菌基因组中的一种不对称的8bp核苷酸序列，5′-GCTGGTGG-3′，Chi位点能够改变RecBCD的酶活性，它是大肠杆菌重组过程的必需组分，是重组的热点。一旦RecBCD识别出Chi序列，RecBCD核酸酶活性便发生变化，其3’→5’外切酶活性受到抑制，5’→3’外切酶活性被激活，由原来优先降解3’末端链，改变为只降解5’末端链。但是它的解旋酶活性未受到影响。RecBCD酶活性变化的结果是产生3’末端带有Chi位点的ssDNA。单链的侵入（strandinvasion）由RecA蛋白介导。RecA是一种单链DNA结合蛋白，参与大肠杆菌中所有的同源重组事件。它催化一个双链DNA分子的3－末端单链区侵入另一个双链DNA分子，形成异源双链区，同时置换出同源单链，形成Holliday结构。RecA介导的链交换可以分为三个阶段：RecA聚集在ssDNA上形成丝状结构的联会前阶段；RecA－ssDNA丝装结构寻找同源双链DNA分子并与之配对的联会阶段，在这一阶段可能形成三股螺旋（triplex）结构，入侵的ssDNA位于完整螺旋的大沟之中；发生链的交换，形成连接分子的阶段，入侵的单链置换出双链中的同源单链，产生一个长的异源双链区。分支迁移和Holliday中间体的拆分分支迁移由结合在Holliday分支点上的RuvA和RuvB蛋白催化。RuvA以四聚体的形式识别并结合到Holliday分支点上。RuvB蛋白为催化分支迁移的解旋酶，但RuvB自身不能有效地与DNA结合，它需要与RuvA一起起作用。RuvC蛋白催化断裂反应，切开极性相同的两条单链，拆分Holliday中间体。5.真核细胞的同源重组发生在减数分裂过程中的同源重组有两方面的重要作用。一是确保同源染色体能够正确配对，而同源染色体的联会是生殖细胞形成时染色体数目减半的基础。另外，减数分裂重组也常常引起非姊妹染色单体之间的交换，结果是亲本DNA分子上的等位基因在下一代发生了重新排列。减数分裂重组是由染色体DNA双链断裂启动的。在减数分裂的前期I同源染色体开始配对的时候，Spo11蛋白在染色体的多个位置上切断DNA。Spo11的切割位点在染色体上并非随机分布，而是多分布于染色体上核小体包装疏松的区域。Spo11蛋白由两个亚基组成，每个亚基上特异的酪氨酸分别进攻DNA分子两条单链上的磷酸二酯键，从而切断DNA，并且在断裂处形成磷酸－酪氨酸连接，所以Spo11与拓扑异构酶及位点特异性重组酶具有同样的性质。在断裂处，MRX酶复合体利用其5’→3’的外切酶活性降解DNA，生成3’单链末端，其长度通常可达1Kb或更长。MRX酶复合体由Mre11，Rad50和Xrs2三个亚基组成，并以三个亚基的首字母命名。MRX酶复合体还被认为能除去与DNA相连的Spo11。在真核细胞中已经发现了两种与细菌RecA蛋白同源的蛋白质：Rad51和Dmc1。这两种蛋白质在减数分裂重组中发挥重要作用。Rad51在进行有丝分裂和减数分裂的细胞中广泛表达，而Dmc1则仅在细胞进入减数分裂时被表达。依赖Dmc1的重组倾向于发生在非姊妹染色单体之间。减数分裂重组可能是通过促进同源染色体的交联，而帮助待分离的同源染色体间的联会的。除了鉴定出引起DNA双链断裂的Spo11、生成3’－单链末端的MRX以及介导链交换的蛋白质外，还发现了许多其他的蛋白质参与这一过程，例如，Rad52和Mus81。Rad52通过抵抗RPA的作用而启动Rad51蛋白丝的组装。因此，Rad52与大肠杆菌的RecBCD蛋白有相似的活性，RecBCD蛋白可以帮助RecA结合在原本被SSB所结合的单链DNA上，而Mus81蛋白可能是拆分Holliday中间体的酶。二、位点特异性重组位点特异性重组是发生在DNA上特定序列之间的重组，不依赖于DNA顺序的同源性，由能识别特异DNA序列的蛋白质介导，并不需要RecA蛋白和单链DNA。λ噬菌体DNA侵入大肠杆菌细胞后，面临着裂解生长和溶原生长的选择。要进入溶原状态，游离的λ噬菌体DNA要插入到宿主的染色体DNA中去，这个过程称为整合（integration）。由溶原生长进入裂解生长，λDNA又必须从宿主染色体上切除下来，这个过程称为外切（excision）。这里，整合和外切均需要通过细菌DNA和λDNA特定位点之间的重组来实现，这些位点称为att位点（attachmentsite）。如果受到诱导（induction），原噬菌体将从细菌基因组中切除（excision）。原噬菌体的切除需要两种噬菌体编码的蛋白质：整合酶（Int）和切