细菌质粒提取原理及步骤(精)

质粒提取原理及步骤一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：1.细菌培养物的生长。2.细菌的收获和裂解3.质粒DNA的纯化。（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。此时，不必造反性地扩增质粒DNA。然而，较长一代的载体(如pBR322由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。1大质粒(大于15kb容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。2可用更剧烈的方法来分离小质粒。在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。3一些大肠杆菌菌株(如HB101的一些变种衍生株用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类，当随后用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的区带。因此很难避免质粒DNA内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。故从诸如HB101和TG1等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。4当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株(endA+株，如HB101中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在温育(如用限制酶消化时，质粒DNA会被降解。但如果通过一个附加步骤(用酚：氯仿进行抽提可以避免此问题。５目前这一代质粒的拷贝数都非常高，以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒DNA的产量，而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积。大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA的量大致相等。(三质粒DNA的纯化常使用的所有纯化方法都利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环状这样两个性质。例如，用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所不同。溴化乙锭通过嵌入奋不顾身碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加，从而阻止了溴化乙锭分了的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多的染料，直至达到饱和(每２个碱基对大约结合１个溴化乙锭分子。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分了在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。多年来，氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA的首选方法。然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。本实验室采用离子交换层析法已可得到极高纯度的质粒。二、质粒DNA的小量制备质粒ＤＮＡ的小量制备可采用下述的碱裂解法或煮沸法（一）细菌的收获和裂解１．收获１）将2ml含相应抗生素的ＬＢ加入到容量为15ml并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于30℃剧烈振摇下培养过夜。２）将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以12000g离心30秒，将剩余的培养物贮存于4℃。３）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。２．碱裂解法１）将细菌沉淀，所得重悬于100μl用冰预冷的溶液Ｉ中，剧烈振荡。溶液Ｉ:50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris．Cl(pH8.010mmol/LEDTA(pH8.0溶液Ｉ可成批配制，每瓶约100ml,在10lbf/in2(6.895×104Pa高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。须确使细菌沉淀在溶液Ｉ中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。２）加200μl新配制的溶液Ⅱ。溶液Ⅱ0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）1%SDS盖紧管口，快速颠倒离心管５次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。３）加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ溶液Ⅲ5mol/Ｌ乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上３－５分钟。４）用微量离心机于4℃12000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。５）可做可不做：加等量酚：氯念，振荡混匀，用微量离心机于4℃以12000g离心２分钟，将上清转移到另一良心管中。有些工作者认为不必用酚：氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA。６）用２倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA。振荡混合，于室温放置２分钟。７）用微量离心机于4℃以12000g离心５分钟。８）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽量使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。９）用1ml70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，按步骤8）所术方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。i.此法制备的高拷贝数质粒（如Ｘf3或pUC），其产量一般约为：每毫升原细菌培养物3－5μg。ii．如果要通过限制酶切割反应来分析DNA，可取1μlDNA溶液加到另一含８μl水的微量离心管内，加1μl10×限制酶缓冲液和１单位所需限制酶，在适宜温育1－2小时。将剩余的DNA贮存于－20℃。iii.此方法按适当比例放大可适用于100ml细菌培养物：３．煮沸裂解１）将细菌沉淀，所得重悬于350μlSTET中。STET0.1mol/LNaCL10mmol/LTris.Cl(pH8.01mmol/LEDTA(pH8.05%TritonX-100２）加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,用10mmol/LTris.Cl(pH8.0配制]，振荡3秒钟以混匀之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。３）将离心管放入煮沸的水浴中，时间恰为40秒。４）用微量离心机于室温以12000g离心10分种。５）用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。６）在上清中加入40μl5mol/L乙酸钠（pH5.2）和420μl异丙醇，振荡混匀，于室温放置5分钟。７）用微量离心机于4℃以12000g离心5分种，回收核酸沉淀。８）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。９）加1ml70％乙醇，于4℃以12000g离心２分钟。10）按步骤8）所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体（2－5）分钟。11）用50μl含无DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE(pH8.0溶解核酸稍加振荡，贮存于-20℃。注：当从表达内切核酸酶Ａ的大肠杆菌株（endA+株，如HB101）中小量制粒尤其DNA时，建议舍弃煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶Ａ，以后在Mg2+存在下温育（V中用限制酶时）质粒DNA可被降解。在上述方案的步骤９）之间增加一步，即用酚：氯仿进行抽提，可以避免这一问题。（二）质粒ＤＮＡ小量制备的问题与对策裂解和煮佛法都极其可靠，重复性也很好，而且一般没有会么麻烦。多年来，在我们实验室中日常使用这两种方法的过程中，只碰到过两个问题：１）有些工作者首次进行小量制备时，有时会发现质粒DNA不能被限制酶所切割，这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。如果总是依然存在，可用离心柱层析注纯化DNA。２）在十分偶然的情况下，个别小时制备物会出现无质粒DNA的现象。这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。三、质粒ＤＮＡ的大量制备（一）在丰富培养基中扩增质粒许多年来，一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效，然而在带有pMBl或ColEl复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中，采用以下步骤可提高产量至每500ml培养物2－5mg质粒DNA，而且重复性也很好。１）将30ml含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期（DNA600约0.6。培养基中应含有相应抗生素，用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体闭关物进行接种。２）将含相应抗生素的500mlＬＢ或Terrific肉汤培养基（预加温至37℃）施放入25ml对数晚期的培养物，于37℃剧烈振摇培养25小时（摇床转速300转/分），所得培养物的OD600值约为0.4。３）可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液（34mg/ml溶于乙醇），使终浓度为170μg/ml。像pBR322一类在宿主菌内只以中等拷贝娄竿行复的质粒，有必要通过扩增。这些质粒只要从生长达到饷新一代的质粒（如pUC质粒）可复制达到很高的拷贝数，因此无需扩增。这些质粒只要从生长达到饱和的细菌培养物即可大量提纯。但用氯霉素进行处理，具有抑制细菌复制的优点，可减少细菌裂解物的体积和粘稠度，极大地简化质粒纯化的过程。所以一般说来，尽管要在生长中的细菌培养物里加入氯霉素略显不便，但用氯霉素处理还是利大于弊。４）于37℃剧烈振摇（300转/分），继续培养12-16小时。（二）细菌的收获和裂解１．收获１）用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。２）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。STE0.1mol/LNaCl10mmol/LTris.Cl(pH8.01mmol/LEDTA(pH8.0２）按步骤１）所述方法离心，以收集细菌细胞。２，碱裂解法１）将冼过的500ml培养物的细菌沉淀物[来自收获细菌的