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Therecanbemiracleswhenyoubelieve！-1-选修三现代生物科技专题【第一讲】基因工程基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫DNA重组技术。一、基因工程的基本操作工具1．限制性核酸内切酶（1）识别序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如GCGCCGCG以中心线为轴，两侧碱基互补对称；CCAGGGGTCC以AT为轴，两侧碱基互补对称。（2）切割后产生末端的种类——黏性末端和平末端。①黏性末端：是限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开时形成的（错位切），如下图所示：②平末端：是限制酶在识别序列的中轴线切开时形成的（平切），如下图所示：2．限制酶与DNA连接酶的关系易误提醒关于工具酶的五个注意点（1）限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。（2）为使目的基因与载体形成相同的DNA片段末端连接，通常使用同一种限制酶将二者切割，但如果不同的限制酶切割DNA分子所产生的末端也存在互补关系时，则两末端也可连接。（3）限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。（4）限制酶是一类酶，而不是一种酶。（5）DNA连接酶起作用时，不需要模板。要点突破与DNA分子相关的几种酶的比较质粒是一种祼露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，能够自我复制的很小的双链环状DNA分子。获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性末端或平末端。Therecanbemiracleswhenyoubelieve！-2-项目种类作用底物作用部位作用结果限制酶DNA分子磷酸二酯键形成黏性末端或平末端DNA连接酶DNA分子片段磷酸二酯键形成重组DNA分子DNA聚合酶脱氧核苷酸磷酸二酯键形成新的DNA分子DNA（水解）酶DNA分子磷酸二酯键形成脱氧核苷酸解旋酶DNA分子碱基对间的氢键形成单链DNA分子3．载体具备的条件条件目的稳定并能大量复制目的基因稳定存在且数量可扩大有一个至多个限制酶切割位点可携带多个或多种外源基因具有特殊的标记基因便于重组DNA的鉴定和选择二、基因工程的基本操作程序1．目的基因的获取（1）直接分离从基因文库中获取利用PCR技术扩增（2）人工合成化学合成法：针对已知核苷酸序列的较小基因反转录法：以RNA为模板，在反转录酶的作用下人工合成要点突破PCR技术与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理DNA双链复制（碱基互补配对）原料四种游离的脱氧核苷酸条件模板、ATP、酶等不同点解旋方式DNA在高温下变性解旋解旋酶催化场所体外复制主要在细胞核内酶热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）细胞内含有的DNA聚合酶已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要．．．模板PCR技术扩增目的基因（1）PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。（2）目的：获取大量的目的基因（3）原理：DNA双链复制（4）过程：·第一步：加热至90～95℃DNA解链为单链；·第二步：冷却到55～60℃，引物与两条单链DNA结合；·第三步：加热至70～75℃，TaqDNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。（5）特点：指数（2n）形式扩增Therecanbemiracleswhenyoubelieve！-3-结果在短时间内形成大量的DNA片段形成整个DNA分子2．基因表达载体的构建（1）基因表达载体的组成及作用：（2）构建过程：3．将目的基因导入受体细胞生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法显微注射技术感受态细胞法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子4．目的基因的检测与鉴定拓展深化关于操作过程的几个注意点①只有第三步将目的基因导入受体细胞不需碱基互补配对，其余三个步骤都涉及碱基互补配对：第一步存在逆转录法获得DNA，第二步存在黏性末端连接现象，第四步存在检测分子水平杂交。②工具酶只有两种：限制酶在操作程序1、2中用到且要求用同一种，目的是产生相同的黏性末端；DNA连接酶只在操作程序2中用到。③目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。④限制酶剪切目的基因与质粒的次数不同：获取一个目的基因需限制酶剪切2次，共产生4个黏性末端或平末端，切割质粒则只需要限制酶剪切1次，因为质粒是环状DNA分子，而目的基因在DNA分子链上。⑤切割目的基因和载体并非只能用同一种限制酶：如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。Therecanbemiracleswhenyoubelieve！-4-⑥目的基因的插入点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。三、蛋白质工程蛋白质工程与基因工程的关系项目蛋白质工程基因工程区别过程预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定实质定向改造或生产人类所需的蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品结果可生产自然界没有的蛋白质只能生产自然界已有的蛋白质联系①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造四、基因工程的理论基础（下图左）五、基因工程的应用成果（上图右）1．乳腺生物反应器与微生物生产的比较2．基因治疗①抗病②抗逆③生长速度④品质⑤药物⑥器官移植特别提醒①乳腺生物反应器受生物性别的限制，若从动物尿液中提取目的基因产物则不受性别限制。②基因治疗是治疗人类遗传病的根本方法，但由于尚未全面了解基因调控机制和疾病的分子机理，基因治疗只处于初期的临床试验阶段。基因工程的目的不同，可选用的受体细胞不同：·培育转基因动物，受体细胞一般选用受精卵。·培育转基因植物，受体细胞可选用受精卵或体细胞，若选用体细胞，再通过植物组织培养，即可获得转基因植株。·若生产基因工程药品，受体细胞一般选用细菌，利用细菌繁殖速度快的特点，可在短期内获得大量产品。Therecanbemiracleswhenyoubelieve！-5-【第二讲】细胞工程细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过细胞水平或细胞器水平上的操作，按照人的意愿来改变细胞内的遗产物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。一、植物细胞工程（一）植物细胞的全能性1、概念：已经分化的细胞，仍然具有发育成完整个体的潜能2、原因：细胞内有全套的遗传物质3、全能性表达的难易程度：受精卵生殖细胞干细胞体细胞；植物细胞动物细胞；分化程度低的分化程度高的4、植物体内细胞为何没有发育成完整个体呢？因为在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会有选择性地表达出各种蛋白质，从而构成生物体的不同组织和器官5、条件：完整的细胞结构；离体；无菌；激素（植物生长调节剂）；营养物质；适宜的外界条件（适宜温度、光照）（二）植物组织培养1、概念：植物组织培养就是在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导．．（脱分化）其产生愈伤组织、丛芽，最终（再分化）形成完整的植株2、原理：植物细胞的全能性，即具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整生物体的潜能。3、技术流程：离体的植物器官、组织或细胞脱分化愈伤组织或丛芽再分化根、芽→完整植株※植物组织培养过程中注意的问题胚状体人造胚乳和种皮人工种子（1）取材：选取有形成层的部位最容易诱导形成愈伤组织。（2）该过程为无性繁殖，细胞分裂方式为有丝分裂，包含脱分化和再分化两个阶段。（3）愈伤组织是脱分化、高度液泡化呈无定型状态的薄壁细胞（细胞内有很多的小液泡，细胞排列松散而无规则），细胞内无．叶绿体，不能进行光合作用，只能以现成有机物来提供物质和能量；其代谢方式为异养、需氧；该过程进行有丝分裂，故愈伤组织应是具有．．细胞周期的细胞；愈伤组织为脱分化后形成的细胞，故应视为未分化的细胞（同受精卵一样，未分化）。（4）获取细胞产品的时期应为脱分化之后再分化之前的愈伤组织；制作人工种子需要再分化后形成的胚状体阶段。（5）接种后的组织块要放在23~26℃恒温避光培养，因为有光易形成维管组织；愈伤组织诱导出试管苗后，则需要光照，移栽到大田※植物激素在植物组织培养中的作用生长素/细胞分裂素的比值作用效果比值高时促进根分化、抑制芽形成比值低时促进芽分化、抑制根形成所用器械必须灭菌，实验人员也必须无菌操作：避免杂菌在上面迅速生长消耗营养，且有些杂菌会危害培养物的生长固体培养基大多数是由无机营养成分、有机营养成分、激素、琼脂四部分组成具有全能性≠体现(实现)全能性。①具有全能性：理论上，活细胞都具有全能性。②体现全能性：只有发育成完整个体，才能说明实现了细胞的全能性。人工种皮中可加入适量营养成分，无机盐，有机碳源以及农药、有益菌等，为了促进胚状体生长发育，还可以加入一些植物生长调节剂且人工种皮应适用于运输、贮存，还要透气Therecanbemiracleswhenyoubelieve！-6-比值适中促进愈伤组织形成（三）植物体细胞杂交1、概念：植物体细胞杂交就是将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并且把杂种细胞培育成新的植物体的技术。2、过程：（1）融合包括膜融合和核融合，融合的标志是新的细胞壁的生成。植物体细胞杂交技术的最终结果是获得杂种植株，而不是杂种细胞。（2）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电激等。化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。3、原理：全能型株：利用了细胞的杂种细胞发育成杂种植细胞膜的流动性原生质体融合：利用了4、意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。5、杂种植株特征：具备两种植物的遗传特征，因为杂种植株中含有两种植物的遗传物质。※易混点：对植物体细胞杂交和有性杂交辨析不清。①植物体细胞杂交：若两个不同品种的植物细胞A、B进行融合，A含有2X条染色体，2个染色体组，基因型为Aabb，B含有2Y条染色体，2个染色体组，其基因型为ccDd，则新植株应为四倍体，其体细胞中染色体数为2X＋2Y，基因型为AabbccDd，从中不难看出，体细胞杂交即两个细胞融合成一个细胞，不管是染色体数、基因型还是染色体组都采用直接相加的方法。②植物有性杂交：有性杂交的子代细胞中染色体数、基因型分别为“X+Y”、“AbcD”或“abcD”或“Abcd”或“abcd”，即先减半再相加。（四）植物细胞工程的实际应用1、植物繁殖的新途径（1）微型繁殖：是用于快速繁殖优良品种的植物组织培养技术，实际上是无性生殖的一种。在繁殖的过程中，细胞进行有丝分裂，因此亲、子代细胞内DNA相同，具有相同的基因，因此能保证亲、子代遗传特性不变。利用这种技术能高效快速．．．．实现种苗的大量繁殖。（2）作物脱毒：由于植物分生区附近的病毒极少，甚至无病毒。由茎尖进行组织培养，再生的植株就有可能不带病毒，从而获得脱毒苗。用脱毒苗进行繁殖，种植的作物就不会或极少感染病毒。（3）人工种子：采用的还是微型繁殖的技术，但是只需培育得到胚状体、不定芽、顶芽和腋芽，包上人工种皮就可形成人工种子。人工种子与微型繁殖得到的幼苗