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葡萄糖转运蛋白GLUT1的晶体结构宏观评述重点分析一、背景介绍一、结构特征二、研究介绍二、转运机制三、价值意义宏观评述•葡萄糖（D-glucose）是地球上包括从细菌到人类各种生物已知最重要、最基本的能量来源，也是人脑和神经系统最主要的供能物质。葡萄糖代谢的第一步就是进入细胞：亲水的葡萄糖作为一种有机大分子不能自由穿透疏水的脂质双层结构细胞膜进入细胞，其进出细胞需要通过镶嵌于细胞膜上的葡萄糖转运蛋白（glucosetransporters）简称葡萄糖转运体（GLUT）转运功能才能得以实现。其中一类属于主要协同转运蛋白超家族（MajorFacilitatorSuperfamily，简称MFS）的转运蛋白是大脑、神经系统、肌肉、红细胞等组织器官中最重要的葡萄糖转运蛋白（glucosetransporters，简称GLUTs）。背景介绍•(1)GLUT1功能完全缺失将致死，功能部分缺失会使细胞对葡萄糖吸收不足而导致大脑萎缩、智力低下、发育迟缓、癲痫等系列疾病，同时也会因葡萄糖不能及时为人体利用消耗而导致血糖浓度的异常升高。•(2)GLUT1在癌细胞的新陈代谢过程中也发挥着重要功能。癌细胞需要消耗超量葡萄糖也需要通过转运蛋白来摄取，才能维持其生长扩增，由此引起GLUT1在细胞中显著过量往往意味着有癌变发生。因此，如能研究清楚GLUT1的组成、结构和工作机理，就有可能通过调控它实现葡萄糖转运的人工干预，有可能达到治疗相关疾病的目的。研究介绍•首先获得了GLUT1-4在大肠杆菌中的同源蛋白，XylE的结构。XylE在肠杆菌中负责将D-木糖以质子依赖的方式同向转运进入细胞。它与人的GLUT1-4蛋白有着高达50%的序列相似性，进化上高度保守。细菌GLUT1–4同源物XylE分别与D-木糖、D-葡萄糖和6-溴-6-脱氧-d-葡萄糖构成的三种复合物的晶体结构，分辨率分别为2.8、2.9和2.6埃。其三维晶体结构中包含一个典型的由12个跨膜片段和一个独特的四螺旋结构域构成的主要协同转运蛋白超家族(MajorFacilitatorSuperfamily，MFS)折叠。XylE被捕获在一个面向外（outward-facing）、部分闭合的构象中。研究介绍•在研究这些同家族糖转运蛋白的结构与机理过程中，她们对于MFS家族的工作机理有了深入了解，分析出GLUT1结晶的瓶颈在于高度动态、结构不稳定。针对这一问题，她们寻找可以将GLUT1锁定于某一构象的致病突变体，同时利用低温结晶进一步稳定蛋白构象，终于克服了GLUT1重组表达、纯化结晶的一系列技术障碍，获得了GLUT1的晶体结构。价值意义•1、提供的结构和生物化学信息可为了解葡糖糖转运蛋白和糖转运蛋白的功能和机制提供重要的框架。•2、这一结构模型由于是以具有高度同源的XylE蛋白的晶体结构为基础，比以往研究报道的结果更为准确。利用GLUT1的晶体结构可以精确地定位与疾病相关的突变氨基酸，揭示其致病机理。•3、在人类攻克癌症、糖尿病等重大疾病的探索道路上迈出了极为重要的一步。重点分析•GLUT1的三维晶体结构呈现经典的MFS家族折叠方式----12个跨膜螺旋组成N端和C端两个结构域。两个结构域之间的腔孔朝向胞内区，即该结构呈现向内开放构象。而在结晶中用到的去污剂头部恰好是葡萄糖苷，其结合位点与此前XylE中观测到的葡萄糖结合位点基本重合，证实了MFS家族具有单一结合位点。有趣的是，GLUT1在胞内可溶区还具有一个由4个α螺旋组成的结构域（简称ICH），这一序列只在MFS中的糖转运蛋白亚家族中(SugarPortersubfamily)观察到，因此ICH是属于该家族蛋白的特有结构特征。一、结构特征•MFS超家族转运蛋白的结构特征MFS超家族的成员蛋白大多由400~600个氨基酸残基组成,N和C端都位于胞内.蛋白二级结构预测提示其大多具有12次-螺旋跨膜结构域,其他一些具有14或者24次-螺旋的则可能是进化过程中以12次跨膜-螺旋为基础产生的.这种独特的折叠方式也被命名为“MFSfold”.在“MFSfold”中,12次螺旋可以分为2个结构域:N端结构域和C端结构域.每个结构域都由6个-螺旋组成,虽然2个结构域中氨基酸序列只有很低的序列同源性,但从结构上观察2个结构域呈现二次赝对称(two-foldpsudosymmetry).同时MFS超家族蛋白的结构和序列分析提示可能存在3次跨膜重复构成的特性,结构和功能分析都支持MFS蛋白每个结构域都是以3+3反转重复(inverted3+3repeats)的组成.更有意思的是,研究发现一类只有3次跨膜结构域的糖转运蛋白SemiSWEET,它们在细胞膜上可能形成多聚体行使功能.可能从进化上来讲,MFS超家族蛋白是由3次跨膜蛋白融合形成.除了跨膜结构域外,部分MFS超家族蛋白还具有胞内结构域.以XylE和GLUT1为例,在胞内区域还存在几个由-螺旋组成的胞内结构域.螺旋中的多个带电荷氨基酸残基会与跨膜结构域上的氨基酸残基产生相互作用,底物转运实验也已经证实这些位置上的突变会影响转运.进行序列比对发现,这些氨基酸残基在所有的糖转运蛋白中都十分保守,说明这个结构域在该家族中保守,并发挥重要功能二、转运机制•当XylE处在向胞外开放时,Asp27很容易被质子化,质子化的天冬氨酸会引起与它相互作用的氨基酸残基侧链发生构象变化,与此同时,底物分子(木糖)可以进入底物结合位点;与蛋白结合的底物分子可以诱导蛋白发生较大构象变化,使蛋白从向胞外开放变成向胞内开放;随后底物从蛋白上结合位点脱离,Asp27也去质子化,此时构象变得不稳定,蛋白恢复向胞外开放状态.如果Asp27不能去质子化,即使底物从蛋白脱离也不能使蛋白完成空转,将稳定在向胞内开放状态.而GLUT1是一个协助转运蛋白(uniporter/facilitator),它就像一直处于质子化状态下的质子共转运蛋白.底物结合和释放已经可以起到诱导蛋白构象变化的作用,不需要质子参与.•而从进化上讲,对于哺乳动物这样的多细胞生物来说,更多的是需要整个生命体内部的稳态和平衡,像GLUT1这样的协助转运蛋白更有利于个体的生存;而对于大肠杆菌这样的单细胞来说,它们的生存环境本身充满了严酷的竞争,像XylE这样的共转运蛋白可以帮助他们从贫乏的外界摄取更多的营养物质.这其中的原因可能是GLUT1各种不同构象之间的能垒都较低,自由热运动就足以完成构象变化,即使没有底物存在,GLUT1也处在一个高度动态的状况下,底物的出现便能够诱导整个过程.GLUT1的生理功能是维持细胞膜两侧的葡萄糖浓度平衡当两侧葡萄糖浓度等同时,GLUT1同样可能对葡萄糖分子进行转运,完成类似交换.