CRISPR-Cas9技术的发展与应用

CRISPR/Cas9技术的发展与应用Zujia.W摘要：成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列关联蛋白(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associatedproteins,CRISPR/Cas)技术是近两年出现的一种定点基因组编辑新工具，具有灵活、高效、廉价且易于操作等优点。这种新的基因编辑工具的出现，为基因功能、疾病分子机制的研究带来了便利,并且在研究和使用过程中不断创新发展，扩大了其应用范围。关键词：成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列关联蛋白基因编辑转录调控基因治疗ABSTRACT:Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associatedproteins(CRISPR/Cas)hasbeendevelopedasanewtargetedgenomeeditingtoolsincethelast2years.Becauseit'sflexible,efficient,cheapandeasytooperate,itquicklysurpasstheprevioustechnologiestobecomethehottestgenomeeditingtool.Theemergenceofthisnewgeneeditingtoolhavebroughtgreatconvenienceforresearcheringenefunction,molecularmechanismsofdisease.Intheprocessofresearchanduse,thistechnologyisgoingthroughcontinuousinnovationanddevelopment,expandingitsscopeofapplication.Keywords:CRISPR/Casgenomeedtingtranscriptionregulationgenetherapy基因编辑技术指采用一定的方法技术对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的的突变，敲除、插入等改变。基因编辑技术主要包括：化学和UV诱导的基因突变；DNA重组酶介导的基因置换；锌指酶（ZFNs）和类转录激活效应因子核酸酶（TALENs）基因编辑系统，以及2013年问世的以gRNA为向导的CRISPR/Cas系统[1]。CRISPR/Cas系统的组成CRISPR/Cas系统最初在细菌中被发现，是细菌体内重要的适应性免疫的结构基础，帮助细菌抵抗病毒和噬菌体。细菌体内的CRISPR/Cas系统包括介导DNA识别的CRISPRRNA(crRNA)，和介导DNA切割的Cas核酸酶。典型的CRISPR基因主要由Cas基因家族和CRISPR序列原件构成。CRISPR序列是高度保守的一段序列，由严格保守的21-48bp的重复序列（repeats）和高度可变的间隔物序列（Spacers）交相间隔组成。CRISPR基因的典型结构目前，主要鉴定发现了三种CRISPR/Cas系统，而TypeⅡ是最常见最常用的一种CRISPR/Cas系统，该系统发挥作用只需要一种Cas蛋白——Cas9。通过晶体结构分析发现[2]，Cas9蛋白主要包含有两个结构域，分别是发挥识别功能的REC结构域，发挥剪切功能的NUC结构域。其中NUC结构域又由RuvC,HNH和PAM-interacting(PI)组成，当RuvC和HNH同时发挥切割作用时，就可以形成DNA的双链断裂（DSB）。CRISPR/Cas9技术的发展利用CRISPR/Cas9技术，通过设计特异性的sgRNA，可以实现特异性的DNA识别，并且在靶向位置完成切割，再通过细胞本身的DNA修复机制，完成断裂处的修复，从而实现目标基因的“编辑”。随着CRISPR/Cas9技术的广泛应用和研究的深入，从经典的CRISPR/Cas9技术中也衍生出了各种更为精准有效的应用技术。通过修饰改变Cas9的功能结构域，完成了对CRISPR/Cas9技术的一次次创新。一．Cas9切口酶（Cas9nikase,Cas9n）将Cas9蛋白的NUC结构域（切割域）中RuvC或HNH任意一个切割结构位点诱导突变，使其失去切割DNA的活性，这样的Cas9蛋白就称为Cas9切口酶（Cas9nikase,Cas9n）。Cas9n由于其中一个切割活性位点发生突变，就不能完成DNA的双链切割，只能切割DNA的一条链，形成单链断裂（SSB）。如果将Cas9n和两条不同的sgRNA联合使用，就可以形成交错的双链断裂（DSB），再激活DNA的修复机制。这种断裂方式能够进一步提高CRISPR/Cas9系统的特异性和效率，有着深远的意义和应用潜力[3]。二．失活Cas9（DeadCas9，dCas9）将Cas9蛋白的NUC结构域（切割域）中RuvC和HNH两个切割结构位点都诱导突变，获得的Cas9蛋白失去了切割DNA的活性，这种Cas9蛋白称为失活Cas9（DeadCas9，dCas9）。dCas9与sgRNA组成的复合物可以靶向地结合到目标DNA位点，但不能发挥切割、“编辑”的功能，仅仅只起到“识别”的作用。这种dCas9-sgRNA复合体，可以起到“干扰”基因表达的作用。因为dCas9蛋白的结合，影响了基因的表达，或者诱导了目标基因的沉默，所以这种系统也称为CRISPR/Cas9inference（CRISPRi）[4]。除了抑制作用以外，dCas9也可发挥激活基因表达的作用。这种功能通过某种“激活物”（activitor）（如VP16，VP64）[5]与dCas9结合而实现。dCas9通过与一些效应酶或者效应转录因子结合，从而发挥抑制或激活基因表达的作用，这种功能在表观遗传学，癌症，神经失调等研究领域有着巨大的应用潜能。三．光激活Cas9（Light-activatedCas9）Cas9蛋白上的赖氨酸残基是制动CRISPR/Cas9系统的的重要位点，赖氨酸的暴露能够抑制CRISPR/Cas9系统的作用发挥。其中，Cas9蛋白上的163位赖氨酸和886位赖氨酸能够在光的调控下影响CRISPR/Cas9系统的功能[6]。光激活CRISPR/Cas9系统含有两种融合蛋白：（1）CIb1，与Cas9蛋白融合，起到靶向基因组序列的作用；（2）CRY2，一种光敏蛋白，含有一段光解酶的同源区域。当受到蓝光刺激时，CRY2与CIb1异源二聚化，Cas9-CIb1就会大量募集到靶位点，发挥转录调控作用[7]。这种光激活CRISPR/Cas9系统可以受到蓝光照射的调控，在时间上或空间上特异性地发挥基因编辑的作用。CRISPR/Cas9技术的应用一．基因编辑（Genomeediting）CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术在生物工程与生物医学方面有广泛的应用，例如:可快速建立基因突变的动物或细胞模型，从而揭示遗传变异或表观遗传变异与生物功能或疾病之间的关系;可作为新的作物育种技术，实现抗极端环境、病虫害以及无外源DNA残留的重要农作物的快速获得;还可在藻类或玉米中直接导入有效的乙醇合成代谢途径，获得可持续生产的低成本生物燃料;还可利用基因组编辑改造细菌细胞工厂，生产大宗化学品与精细化学品如药品前体等[8]。近些年最为振奋人心的研究结果莫过于利用CRISPR/Cas9技术在人类细胞中阻断了HIV-1的感染[9]。这意味着CRISPR/Cas9技术是我们用于攻克人类复杂疾病、重大疾病的有利工具。二．转录调控除了基因编辑，CRISPR/Cas还被用于调控内源基因的表达。CRISPR干涉(CRISPRinterference,CRISPRi)技术[4]，能够在不改变DNA序列的情况下可逆抑制目的基因的表达，其原理是在gRNA引导下dCas9定向结合到DNA上，对RNA聚合酶复合体产生位阻效应，干扰转录延伸从而降低基因转录水平。三．表观遗传调控表观遗传修饰在生物生长发育和遗传过程中扮演着重要角色。DNA甲基化或组蛋白乙酰化是表观遗传的标记，由一系列的酶调控。将dCas9与组蛋白修饰因子和DNA甲基化相关蛋白融合，能在特定位点人为添加或去除表观遗传标记，这将为研究表观遗传学修饰在调控基因网络中的作用提供一个更灵活的平台。四．RNA编辑除了编辑双链的DNA，CRISPR/Cas9也可用于编辑单链的RNA序列[10]。编辑RNA的CRISPR/Cas9系统由PAMmer，ssRNA，gRNA,Cas9蛋白组成。PAMmer与PAM的功能一样，能被Cas9特异性识别并指导Cas9结合并切割ssRNA。因为RNA比DNA具有更多的功能，所以用于编辑单链的RNA序列的CRISPR/Cas9系统具有更为灵活和广泛的用途。CRISPR/Cas9的伦理和技术挑战尽管CRISPR/Cas9技术为生命科学领域研究带来了很大的便利和提高了工作效率，但是伴随其产生的一些伦理和生物安全问题也必须得要引起我们高度的重视。CRISPR/Cas9技术介导的疾病治疗面临的最大问题是脱靶现象，我们不希望在治好了一种疾病的同时，却带来了另外一个问题。然而，新的全基因组高通量测序技术，结合干细胞技术，使得在基因治疗过程中通过全基因组测序的手段来挑选特定位点被修复，而其他位点又未发生非特异编辑的细胞系来进行进一步的应用成为可能，从而消除人们对干细胞中基因组编辑的安全性的担忧[11]。短短的几年，由在细菌和古细菌等原核生物中发现的遗传物质靶向编辑系统演变而来的CRISPR/Cas9技术取得了令人欣喜的发展，使得研究人员能快速地对遗传物质进行随心所欲地操作或修饰，与成熟的ZFN和TALEN等基因靶向编辑系统相比，CRISPR/Cas9系统具有得天独厚的优越性，如构建简单、方便、快捷，安全性高、毒性小等。相信基于Cas9的基因编辑工具极有可能是未来进行精确和高效的基因修饰的解决办法，在临床治疗、基础理论研究和农牧渔业等领域必将发挥巨大的作用，并且将会对分子生物学研究和基因治疗领域产生深远的影响。参考文献：[1]MaliP,YangL,EsveltKM,etal.RNA-guidedhumangenomeengineeringviaCas9.[J].Science,2013,339(6121):823-826.[2]Nishimasu,H.,Ran,F.A.,Hsu,P.D.,Konermann,S.,Shehata,S.I.,Dohmae,N.,Ishitani,R.,Zhang,F.,Nureki,O.,2014.CrystalstructureofCas9incomplexwithguideRNAandtargetDNA.Cell156,935e949.[3]Ran,F.A.,Hsu,P.D.,Lin,C.Y.,Gootenberg,J.S.,Konermann,S.,Trevino,A.E.,Scott,D.A.,Inoue,A.,Matoba,S.,Zhang,Y.,Zhang,F.,2013a.DoublenickingbyRNA-guidedCRISPRCas9forenhancedgenomeeditingspecificity.Cell154,1380e1389.[4]Cheng,A.W.,Wang,H.,Yang,H.,Shi,L.,Katz,Y.,Theunissen,T.W.,Rangarajan,S.,Shivalila,C.S.,Dadon,D.B.andJaenisch,R.(2013)MultiplexedactivationofendogenousgenesbyCRISPR-on,anRNA-guidedtranscriptionalactivatorsystem.CellRes.,23,1163–1171.[5]Gilbert,L.A.,Larson,M.H.,Morsut,L.,Liu,Z.R.,Br