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第六章DNA重组的操作基因工程生命科学学院外源DNA载体DNA重组分子扩增或表达表达连接转化或转导电穿孔或显微注射原核细胞真核细胞受体细胞？1.基因文库2.PCR3.基因差异表达1.克隆载体2.表达载体生命科学学院生命科学学院第一节DNA的体外重组限制酶—分子剪刀限制酶—分子剪刀连接酶—分子胶水重组DNA分子粘性末端连接效率最高！生命科学学院黏性末端黏性末端1、粘性末端的连接生命科学学院生命科学学院生命科学学院第一节DNA的体外重组1.粘性末端连接创造互补粘性末端的方法有哪些？同种酶同尾酶生命科学学院第一节DNA的体外重组（1）两端具有相同粘末端的DNA分子之间的连接生命科学学院第一节DNA的体外重组碱性磷酸酶：去掉其5’末端的磷酸基，以防质粒DNA的自身环化。注意：目的基因正反向插入；载体与多个目的基因片段重组。1231234434生命科学学院第一节DNA的体外重组（2）两端具有不同粘性末端的DNA分子之间的连接两种不同的限制性内切酶两端会产生非互补的突出端定向重组体生命科学学院第一节DNA的体外重组HindIIIEcoRIHindIIIEcoRI对载体酶切HindIIIEcoRI对基因酶切质粒载体的定向重组碱性磷酸酶？避免了目的基因正反向插入生命科学学院2.平头末端连接第一节DNA的体外重组生命科学学院平末端平末端SmaI限制酶第一节DNA的体外重组生命科学学院T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。（1）直接连接生命科学学院第一节DNA的体外重组（2）人工加尾形成“粘性末端”a）同聚加尾法DNA末端转移酶DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸,利用DNA末端转移酶分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。生命科学学院第一节DNA的体外重组非酶切位点a）同聚加尾法缺点：不能把插入片段再切下来。生命科学学院第一节DNA的体外重组生命科学学院还有哪些方法能够创造粘性末端？生命科学学院第一节DNA的体外重组b）衔接物(linker)连接Linker:用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：生命科学学院第一节DNA的体外重组衔接物(linker)连接生命科学学院第一节DNA的体外重组衔接物(linker)连接优点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。2）能给载体连接上Polylinker缺点：如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段生命科学学院第一节DNA的体外重组c)DNA接头(adapter)连接法adapter:一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。adapter的作用:用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。5‘p-GATCCCGG-OH3’GGCC-p5’BamHIadapter生命科学学院第一节DNA的体外重组缺点：接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。防止自我连接：•先用碱性磷酸酶（CIP）处理接头•以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。DNA接头(adapter)连接法生命科学学院平头末端连接（1）直接连接（2）人工加尾形成“粘性末端”a)同聚加尾法b)衔接物连接c)DNA接头连接法小结PCR?生命科学学院第一节重组DNA分子的构建3.PCR产物的连接（1）在引物的5’端设计酶切位点GCAGAATTC互补序列3’端15~20bp与模板互补；5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列（5’端多余的3~5bp属保护碱基）引物生命科学学院第一节DNA的体外重组引物1GCAGAATTC互补序列模板EcoRI位点5’--3’GCAGAATTC互补序列5’--3’3’模板GCAGAATTC互补序列PCR产物5’--3’3’复性延伸模板模板3’生命科学学院第一节DNA的体外重组GCTAGCCGG互补序列模板BamHI位点-5’3-’复性延伸模板模板3’3’GCTAGCCGG互补序列3’-模板GCTAGCCGGPCR产物互补序列引物23’3’生命科学学院第一节DNA的体外重组BamHIEcoRIBamHIEcoRI对载体酶切BamHIEcoRI质粒载体的定向重组PCR生命科学学院第一节DNA的体外重组（2）与T载体直接连接TaqDNA聚合酶的特性：在DNA双链的3’端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）,因此PCR产物两个3’端一般都有一个AT载体的两个3’端人为地各加一个T：利用TaqDNA聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！TaqDNA聚合酶生命科学学院第一节DNA的体外重组T载体图生命科学学院第一节DNA的体外重组AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶载体PCR产物TATA3.PCR产物的连接（2）与T载体直接连接生命科学学院生命科学学院生命科学学院1.粘性末端连接（1）两端具有相同粘末端的DNA分子之间的连接（2）两端具有不同粘性末端的DNA分子之间的连接2.平头末端连接（1）直接连接（2）人工加尾形成“粘性末端”a)同聚加尾法b)衔接物连接c)DNA接头连接法3.PCR产物的连接（1）在引物的5’端设计酶切位点（2）与T载体直接连接第一节DNA的体外重组生命科学学院思考：怎样进行有效的DNA体外连接？生命科学学院第一节DNA的体外重组二、DNA体外连接应注意的事项1.插入片断与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。BamHIBamHISau3AI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生GATC4个碱基的粘性末端。生命科学学院第一节DNA的体外重组2.插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定向插入由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。双酶切EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI生命科学学院第一节DNA的体外重组（2）起始密码尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。ATGGAATTC载体ATGCGGAATTCT插入片断EcoRIEcoRIATGGAATTCT重组但移码突变！生命科学学院3.防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。生命科学学院三、载体和外源DNA插入片段的连接结果2.载体自身环化连接（能存活）3.载体之间互相连接（能存活）4.插入片段互相连接（不能存活）1.一个载体与一个插入片段重组（能存活）6.几个载体与一个插入片段重组（能存活）5.一个载体与几个插入片段重组（能存活）生命科学学院生命科学学院生命科学学院涂布氨苄青霉素培养基