基因工程原理-第二章DNA重组

基因工程原理PrincipleofGeneEngineering第一章第一节基因工程原理第二章第二章DNA重组第一部分DNA的组成和结构1.1DNA的组成1.2DNA的空间结构线形DNA：环形DNA：1.3DNA复制半保留复制方式复制起始位点（replicationoriginsite）=20877原核生物DNA的复制解旋酶单链结合蛋白DNA拓扑异构酶引物酶DNA聚合酶DNA连接酶=20876真核生物DNA的复制复制子从复制起始点开始复制出的一个DNA分子或一个DNA片段的核苷酸序列。复制子的数量原核生物的染色体DNA：单个真核生物染色体DNA：多个质粒DNA：单个、多个1.4DNA转录启动子和转录区的结构启动子：Promotor，DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域，在许多情况下，还包括促进这一过程的调节蛋白的结合位点。Pribnowbox5’-AGGAGG-3’SD序列Shine-Dalgarnosequence;SDsequence1974年，由J.Shine和L.Dalgarno发现SD序列：在细菌mRNA起始密码子AUG上游10个碱基左右处，有一段富含嘌呤的碱基序列，能与细菌16SrRNA3’端识别，帮助从起始AUG处开始翻译。Pribnowbox5’-AGGAGG-3’SD序列1.5DNA转录终止子（transcriptionterminator）终止子（Terminator）是一段位于基因或操纵组末端的DNA片段，可中断转录作用。原核生物拥有两种类型的终止子，包括：•本体转录终止子（Intrinsictranscriptionterminators）：•ρ-依赖转录终止子（Rho-dependenttranscriptionterminators：——不依赖于蛋白质辅因子就能实现终止作用。——依赖蛋白辅因子才能实现终止作用。这种蛋白质辅因子称为释放因子，通常又称ρ因子，与RNA螺旋酶蛋白复合物。两类终止子有共同的序列特征：在转录终止点前有一段回文序列。富含GC回文序列：双链DNA中含有的两个结构相同、方向相反的序列称为反向重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成局部“十”字形结构。这段序列被称为回文序列。1.6天然DNA的来源和用途•染色体DNA：分离目的基因的主要材料，1000～106kb•病毒DNA：用于构建基因克隆载体,T4、λ…•质粒DNA：用于构建基因克隆载体•线粒体DNA：呼吸作用的基因•叶绿体DNA：光合作用的基因——存在与生物体内的DNA（1）大肠杆菌源质粒DNA的提取（2）λ噬菌体DNA的提取（3）氯化铯法制备植物基因组DNA1.7天然DNA的的提取合适的生物材料——裂解细胞——分离DNA——纯化核检测（1）大肠杆菌源质粒DNA的提取松弛型质粒：加氯霉素严紧型质粒：不加氯霉素（2）λ噬菌体DNA的提取1.8DNA的纯化氯化铯-溴化乙锭连续梯度离心法离子交换层析法琼脂糖凝胶电泳洗脱法“基因纯”试剂纯化从DNA样品中去掉EB2.2.4DNA浓缩2.2.5DNA纯度检测第三次课结束！第二部分基因工程工具酶基因工程工具酶•限制性核酸内切酶•DNA连接酶和激酶•DNA聚合酶和RNA聚合酶•DNA和RNA修饰酶。一、序列特异的DNA限制性内切核酸酶(Restrictionendonuclease,RE）——指能够识别双链DNA分子中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的核酸内切酶。•来源：原核生物•种类：500多种•作用：把外源DNA切割成片段。第一型（TypeI）：能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解第二型（TypeII）：只催化非甲基化的DNA的水解第三型（TypeIII）同时具有修饰及认知切割的作用限制性内切酶的命名和书写：HindIII细菌属名细菌种名菌株酶编号HaemophilusinfluenzaedRE的功能:•防御外源DNA感染,利于遗传的稳定性•RE抑制了细菌种属间的交叉繁殖,但甲基化酶的某些误差,又使得不同菌株间DNA的重组成为可能,利于生物的进化.1968年,从大肠杆菌中分离到了I型RE,1970年,从大肠杆菌中分离到了II型RERE的发现：3.1.1限制性核酸内切酶作用机制OH3’P-5’5’P3’HO（1）在DNA分子双链的特异性识别序列部位,切割DNA分子,形成链的断裂.识别序列:又叫靶子序列,是由4-8个核苷酸组成的特定核苷酸序列.3.1.2限制性核酸内切酶的识别序列旋转对称或二重互补对称连续的:例如：5‘…ABCC’B’A’…3’3’…A’B’C’CBA…5’间断的:5’…ABNBA…3’3’…A’B’N’B’A’…5’EcoRIBamHIGAATTCCTTAAGGGATCCCCTAGG（2）识别序列在DNA分子上出现的频率例如：识别序列核苷酸个数出现识别序列的几率41/44（1/256）61/46(1/4096)λDNA长49000bp，BglII的识别序列为AGATCT所以理论上在λDNA中，BglII识别序列应该出现：49000/4096=12次。实际上，仅出现6次。•同裂酶(isoschizomer)---来源不同,但识别同样的核苷酸靶子序列.例如:HpaII和MspI的识别序列都为5'...C^CGG...3'3'...GGC^C...5'BamHI：5'G^GATCC3‘BclI：5'T^GATCA3‘BglII：5'A^GATCT3'•同尾酶(isocaudamer)----来源不同,识别的核苷酸靶子序列不同,但产生相同的粘性末端.例如:BamHI,BclI,BglII是一组同尾酶切割后的末端是GATC.3.1.3限制性核酸内切酶切割DNA的位点•多数在识别序列内部。•环形DNA切割后的片段数：N线形DNA切割后的片段数：N+1•DNA片段末端种类：粘性末端：磷酸二酯键断裂位置是交错的平末端：断裂位置在对称轴•切割位点表示方法5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’PstI可以表示为：5’-CTGCA↓G-3’反应总体积：20微升酶的用量缓冲液的组成与酶的种类有关反应时间1-3小时。3.1.4限制性核酸内切酶反应系统例：BglⅡ对λDNA的消化13mL蒸馏水2mL10x缓冲液4mL底物DNA1mLRE37℃，1-3小时依次加入：混匀离心升温，使酶失活（65℃10-15min）除去酶蛋白限制性酶切反应一般流程底物DNA：•DNA纯度•DNA分子构型•识别位点侧面序列•位点偏爱•DNA甲基化酶的用量酶的活性底物DNA：位点数量标准缓冲液的组成：缓冲液系统MgCl2（或醋酸镁）NaCl（或KCl）Tris-HClß-巯基乙醇（或二硫苏糖醇DTT）反应温度：大多数是37℃，少数或高或低Star活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA。3.1.5限制性核酸内切酶的Star活性4二、DNA连接酶DNA连接酶能催化双链DNA片段紧靠在一起的3’-OH和5’-P基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。如果是两个或两个以上不同双链DNA片段末端连接，则产生重组DNA分子。3.2DNA连接酶缺口nick5’5’3’3’5’5’3’3’DNA连接酶5’5’3’3’DNA连接酶裂口gap5’5’3’3’nick（2）酶-AMP复合物中的AMP与DNA链上的5’P结合，形成DNA-腺苷酸复合物，P活跃起来（3）3’OH对活跃的P作亲核攻击，结果形成磷酸二酯键。（1）DNA连接酶与辅助因子ATP或NAD+反应,生成酶-腺苷酸复合物.3.2.1DNA连接酶的作用机理E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶√×√√（但效率较低）3.2.2目前常用的DNA连接酶•1条DNA链具有3’-OH,另1条DNA链具有5’-P,而且3’-OH与5’-P是相邻的.•3’-OH与5’-P位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸的末端.•吸能反应:E.coliDNA连接酶需要NAD+，T4DNA连接酶需要ATP.3.2.3DNA连接酶作用条件缺口nick5’5’3’3’5’5’3’3’DNA连接酶5’5’3’3’DNA连接酶裂口gap5’5’3’3’——反应温度：37℃——酶用量：平末端1-2unit粘性末端0.1unit——ATP：10μmol/L—1mmol/L——buffer：Tris-HCl，KCl，DTT，BSADNA连接酶反应条件•具互补粘性末端片段之间的连接•具平末端DNA片段之间的连接•DNA片段末端修饰后进行连接3.2.4DNA片段之间的连接方式具互补粘性末端片段之间的连接具平末端DNA片段之间的连接DNA片段末端修饰后进行连接•DNA片段末端同聚物加尾后进行连接•粘性末端修饰成平末端后连接•DNA片段5’段磷酸化作用后连接DNA片段末端同聚物加尾后进行连接粘性末端修饰成平末端后连接DNA片段5’端脱磷酸化作用后连接5——催化以DNA单链为模板，以4种脱氧核糖核苷酸为底物，合成一条与模板序列互补的DNA新链的酶。三、DNA聚合酶DNA聚合酶包括：•大肠杆菌DNA聚合酶I•大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow大片段酶•T4DNA聚合酶•T7DNA聚合酶•修饰的T4DNA聚合酶•逆转录酶•耐热性DNA聚合酶（一）耐热性DNA聚合酶•1956年，美国Kornberg从大肠杆菌中分离出来。•由大肠杆菌基因polA编码，•单链多肽蛋白质。•分子量：109kD•球形，Φ65埃（二）大肠杆菌DNA聚合酶I（E.coliDNApolI）1.DNA聚合酶I反应需要的条件:•全部4种脱氧核苷三磷酸,和Mg++.dATPdCTPdTTPdGTP•带有3’-OH游离基团的引物链.2.DNA聚合酶I催化的反应(1)聚合反应:5’→3’方向•DNA聚合酶I催化的聚合反应是在引物链3’-OH与dNTP分子的-P-基团间.•dNTP接上后,又提供了1个3’-OH末端,继续连接dNTP分子.•合成方向是5’→3’DNA聚合酶I的聚合反应机理引物模板PPi(2)5’→3’核酸外切酶活性:polIpolI(3)3’→5’核酸外切酶活性:polI3、DNA聚合酶I在基因工程中的应用•DNA缺口转移（nicktranslation）反应——用于分子克隆。•制备高比活的DNA探针。DNA聚合酶I的5’-3’核酸外切酶活性3’3’5’5’nick3’-OH5’-P缺口双链DNA聚合酶I的聚合活性3’3’5’5’nick3’-OH5’-P切去1个5’核苷酸在3’-OH上加上新的核苷酸3’3’5’5’nick3’-OH5’-P32P标记的核苷酸DNA缺口转移——线状分子DNaseI切断DNA链DNA聚合酶I5’-3’核酸外切酶活性DNA聚合酶I的聚合活性形成1条具有32P标记的合成DNA链（标记探针）在5’端切去1个核苷酸切出1个缺口在3’-OH加上1个32P标记的核苷酸32P标记的核苷酸制备高比活的DNA探针•25µl•1µg纯化的目的基因DNA片段；•适量的DNaseI；•DNA聚合酶；•32P-dNTPs；dNTPs；典型的反应体系：（二）大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段与DNA末端标记Klenow聚合酶的特点：•分子量：76×103dal•具有聚合酶的活性•具有3’-5’的核酸外切酶的活性。DNA聚合酶IMW：34×103dal：5’→3’核酸外切酶活性。MW：76×103dal：Klenow片段酶，保留DNA聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性。枯草杆菌蛋白酶Klenow聚合酶的应用：•cDNA克隆中第二链合成的催化•补平双链DNA的3’凹端。•标记DNA片段的末端：带标记的dNTP•DNA序列测定：Sanger末端终止法cDNA的合成第二链DNA的合成加SalI衔接物加EcoRI衔接