基因的体外重组和转化

外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连接转化或转导电穿孔或显微注射受体细胞7基因的体外重组与转化7基因的体外重组与转化1DNA片段的体外连接2重组体导入细菌细胞3重组噬菌体DNA的体外包装与转导4重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染重组过程中，需要考虑的因素：（1）连接效率高、易于筛选；（2）便于回收外源基因；（3）在载体的启动子控制之下，并置于正确的阅读框之中，以便表达。基因的重组是依赖于限制性内切酶、DNA连接酶和修饰酶的作用，分别对外源基因和载体进行适当切割和修饰后，将外源基因和载体巧妙地连接在一起。1DNA片段的体外连接一、粘性末端的连接二、平末端的连接三、PCR产物的连接四、体外连接应注意的事项五、体外连接的结果体外连接DNA连接酶：由大肠杆菌基因组DNA编码，以NAD+作为能源辅助因子。；只能连接粘性末端T4DNA连接酶：由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码，以ATP作为能源辅助因子。1970年：容易制备，而且可以连接平末端DNA分子及单链DNA(RNA)分子，所以在基因克隆中应用广泛。ＤＮＡ连接酶一、粘性末端的连接利用粘性末端单链间的碱基互补，并用DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起。1.两段DNA的连接依靠粘性末端2.DNA片断与载体的连接依靠粘性末端3.载体与载体的连接二、平末端（bluntend）的连接5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。1.直接连接T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’5’5’5’3’3’3’3’-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’3’-OH-PP-HO-5’3’1972年，斯坦福大学的P.Labban和P.Kaiser提出。（1）同聚物加尾法2.人工加尾形成“粘性末端”末端脱氧核苷酸转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。①原理：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。②加尾—碱基互补④缺点：③优点：能把任何片段连接起来不能把插入片段再切下来。非酶切位点用T4DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。（2）衔接物(linker)连接①linker用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：②linker的作用④缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段2）能给载体连接上Polylinker:③优点：（3）DNA接头(adapter)连接法1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。5‘p-GATCCCGG-OH3’GGCC-p5’BamHIadapter用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。①adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。②adapter的作用Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’接头自我连接接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。③优点：连上后就能用。④缺点：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）⑤防止自我连接碱性磷酸酶处理质粒载体为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ的浓度，增加重组子比例。这样就会出现ＤＮＡ自生连接问题，为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化，通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修复。载体自连及去磷酸化示意图常用碱性磷酸酶BAP（大肠杆菌）CIP(小牛肠)分子量80,000温度60℃—65℃最适PH8.0热稳定性好，100℃暂时性失活，室温放置可恢复活性，苯酚完全失活分子量100,000温度37℃最适PH10.0附近（高底物浓度）PH8.0附近（低底物浓度）65℃30分钟处理99％的活性不可逆失活，随具体条件改变有变动，完全失活苯酚处理5‘p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-PP-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5’CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’CIP处理Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘GATCCCGG-HO-GGCCCCGG-OH-GGCCCTAG5’5’HO-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC5’缺口缺口HO--OHCIP处理T4ligase虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。连接体系载体DNA50ng0.5ul目的DNA19ng?ul双蒸水?ul5ul连接反应液（2×）5ul总体积10ul用加样器柔和吹打混匀,16℃连接2小时。附注：载体和目的基因的摩尔比为1:350ng:5.4kb=6.3ng:0.7kb6.3ng*3=19ng1.载体和插入片段的摩尔浓度比载体：插入片段的摩尔数的变化范围可为8：1到1：16，但通常的变化范围是3：1到1：3。在最小的反应体积中，通常一个连接反应用10-50ng的载体DNA。2.平末端连接在22℃保温4-16小时，粘性末端在22℃保温3小时，或16℃保温16小时。大多数连接反应用T4DNA连接酶，但大肠杆菌的DNA连接酶可用于粘性末端的连接，平末端连接时用此酶，活力较低。3.载体和插入片段的纯度应较高，溶解的溶剂最好使用灭菌的双蒸水而不是TE，毕竟TE中含有离子，可能影响连接反应。连接反应中值得注意的几个问题三、PCR产物的连接1.在引物的5’端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；（1）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构3’端15~20bp与模板互补；5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。（5’端多余的3~5bp属保护碱基）避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。引物1GCAGAATTC互补序列模板EcoRI位点5’--3’GCAGAATTC互补序列5’--3’3’模板GCAGAATTC互补序列PCR产物5’--3’3’复性延伸模板模板3’3’GCTAGCCGG互补序列模板BamHI位点-5’3-’5’复性延伸模板模板3’3’GCTAGCCGG互补序列-5’3’-模板5’GCTAGCCGGPCR产物互补序列-5’3’-引物2带酶切位点的PCR产物GCAGAATTCPCR产物5’--3’GCTAGCCGGPCR产物-5’3’-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位点BamHI位点AATTCPCR产物5’--3’GCTAGPCR产物-5’3’-GCEcoRIBamHI两头各有一个粘性末端！2.与T载体直接连接（1）PCR产物两个3’端一般都有一个ATaqDNA聚合酶的特性：在DNA双链的3’端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）。（2）T载体的两个3’端人为地各加一个T利用TaqDNA聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶载体PCR产物TATA四、DNA体外连接应注意的事项1.插入片断与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生GATC4个碱基的粘性末端。2.DNA插入的方向正确（1）用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI3.插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定向插入（2）起始密码尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。ATGGAATTC载体ATGCGGAATTCT插入片断EcoRIEcoRIATGGAATTCT重组但移码突变！4.防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。5’3’载体插入片断五、载体和外源DNA插入片段的连接结果1.载体自身环化连接2.载体之间互相连接3.插入片段互相连接4.一个载体与几个插入片段重组五、载体和外源DNA插入片段的连接结果5.几个载体与一个插入片段重组7（能存活）（能存活）（不能存活）（能存活）（能存活）1972年，美国斯坦福大学的伯格（P.Berg）等人于把一种猿猴病毒的DNA与λ噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子。1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，第一次完整地建立起了基因克隆体系。美国总统国家科学奖中国科学院爱因斯坦讲席教授、美国国家科学院院士、美国斯坦福大学教授斯坦利•科恩(StanleyN.Cohen)StanleyCohen教授发明该专利时的笔记照片-重组DNA专利从批准该专利到该专利1997年12月2日失效的17年中，该专利一共许可了468家公司，两所大学共获得了许可费收入约2.55亿美元。2重组体导入细菌细胞一、感受态大肠杆菌的制备二、重组DNA导入大肠杆菌1.热休克法2.电转化法4.体外包装的噬菌体的转导重组体导入细菌细胞3.农杆菌介导法重组体的转化受体细胞重组体的转化由流动镶嵌模型发展而来的生物膜结构模型黑膜试验不同分子通过无膜蛋白的人工脂双层1.目的增加受体菌细胞膜的通透性。一、感受态大肠杆菌的制备原核细胞的转化（细菌转化）1)受体细胞的选择限制缺陷型:避免修饰和降解重组缺陷型：避免重组整合转化亲和型：较高的可转化性遗传互补型：利于筛选感染缺陷型：防止感染实验中使用的受体细胞为大肠杆菌DH5alpha菌株。使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。2.菌种用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3.制备原理CaCl2诱导转化特殊处理受体细胞细胞膜特性改变CaCl2处理受体细菌50-100mmol/LCaCl2感受态细菌重组体转入细菌4.制备过程培养大肠杆菌OD600至0.5Onice5-10min4℃离心3000g10min收集菌用冰冷的50mMCaCl2重悬4℃离心收集菌4℃离心收集菌分装、-70℃冻存用冰冷的50mMCaCl2重悬Onice30min用冰冷的50mMCaCl2重悬（15%甘油）3离心3重悬2冰浴CaCl2法制备感受态细胞流程１．将宿主菌在琼脂培养基平板上划线，37℃培养16～20小时。２．挑取单菌落转入10mlLB培养基（100ml-胰蛋白胨1g，酵母提取液0.5g，NaCl1g，dH2O）中，37℃振荡培养过夜。３．从中吸取1ml转入50mlLB培养基中37℃振荡培养，测OD600达0.4～0.6。４．培养物在冰浴中放置10分钟。５．取1.5ml加入预冷的Eppendorf管中，于5000rpm下室温离心2--5分钟。６．弃上清，加入1ml用冰预冷的0.05MCaCl2，混匀，置冰上10分钟。７．5000rpm4℃离心10分钟，弃上清，加100ul0.05MCaCl2重悬，置冰浴备用或于4℃短期保存。８．若欲将制备的感受态细胞长期保存，将制备的细胞重悬于含有15％甘油的0.05MCaCl2中，放入-80℃冰箱或液氮中冻存。。转化-热激发取制备好的感受态细胞，置于冰浴上；向感受态细胞中加入连接产物（不超过转化体系的1/10体积），柔和混匀后冰浴上放置30min；将连接体系放入42℃水浴中热激90se