基因的重组与转移

外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连接转化或转导电穿孔或显微注射受体细胞第六章基因的重组与转移第一节重组DNA分子的构建一、基因重组概念利用限制性内切酶和其他一些酶类，切割和修饰载体DNA和目的基因，将两者连接起来，再转入受体细胞，以期这种外源性的目的基因在受体细胞内得到正确表达。二、基因重组的考虑因素1.实验步骤简单易行，连接效率较高，易于重组子筛选2.能够回收插入的外源基因3.外源基因必须在表达载体DNA的控制下，并置于正确的阅读框架内，以便目的基因的正确表达三、表达载体DNA理想的酶切位点应该符合下面几个条件1.载体上特定的酶切位点尽可能少最好是单一酶切位点2.酶切位点之前要有一个较强的启动子高效表达（一）粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起四、载体DNA与外源基因片段的连接1.两段DNA的连接依靠粘性末端2.DNA片段与载体的连接依靠粘性末端ligasenick(二)平齐末端（bluntend）的连接5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。1.直接连接T4－DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’5’5’5’3’3’3’3’-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’3’-OH-PP-HO-5’3’（1）同聚加尾法2.人工加尾形成“粘性末端”DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。①原理：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。②加尾—碱基互补④缺点：③优点：能把任何片段连接起来不能把插入片段再切下来。非酶切位点用T4DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。（2）连接子(linker)连接①linker用化学合成法合成的一段8-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：②linker的作用④缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段2）能给载体连接上Polylinker:③优点：（3）DNA接头(adapter)连接法1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。5‘p-GATCCCGG-OH3’GGCC-p5’BamHIadapter用T4－DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。①adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。②adapter的作用Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’5‘p-GATCCCGG-GGCC-CCGGGGCCCTAG-P5’CCGGGATCCCGG-OHGGCCCTAGGGCC-P5’接头自我连接接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。③优点：连上后就能用。④缺点：先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。（以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）⑤防止自我连接5‘p-GATCCCGG-OHHO-GGCC-PP-CCGG-OHHO-GGCCCTAG-P5’CCGGGATCCCGG-OHHO-GGCCCTAGGGCC5’接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！5‘GATCCCGG-OHHO-GGCC5’5’CCGG-OHHO-GGCCCTAG5’CIP处理Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘GATCCCGG-HO-GGCCCCGG-OH-GGCCCTAG5’5’GATCCCGG-OH3’HO-GGCC5’缺口缺口HO--OHCIP处理T4ligase虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。(三)PCR产物的连接1.在引物的5’端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；（1）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构3’端15~20bp与模板互补；5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。（5’端多余的3~5bp属保护碱基）避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。引物1GCAGAATTC互补序列模板EcoRI位点5’--3’GCAGAATTC互补序列5’--3’3’模板GCAGAATTC互补序列PCR产物5’--3’3’复性延伸模板模板3’3’GCTAGCCGG互补序列模板BamHI位点-5’3-’5’复性延伸模板模板3’3’GCTAGCCGG互补序列-5’3’-模板5’GCTAGCCGGPCR产物互补序列-5’3’-引物2带酶切位点的PCR产物GCAGAATTCPCR产物5’--3’GCTAGCCGGPCR产物-5’3’-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位点BamHI位点AATTCPCR产物5’--3’GCTAGPCR产物-5’3’-GCEcoRIBamHI两头各有一个粘性末端！2.与T载体直接连接（1）PCR产物两个3’端一般都有一个ATaqDNA聚合酶的特性：在DNA双链的3’端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）。（2）T载体的两个3’端人为地各加一个T利用TaqDNA聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶载体PCR产物TATA(四)DNA体外连接应注意的事项1.插入片断与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。决不能进行非粘性末端连接。EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生GATC4个碱基的粘性末端。2.DNA插入的方向正确（1）用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI3.插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定向插入（2）起始密码尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。ATGGAATTC载体ATGCGGAATTCT插入片断EcoRIEcoRIATGGAATTCT重组但移码突变！4.防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。5’3’载体插入片断（4）使用同尾酶产生的粘性末端连接方法酶切反应后不必将核酸内切酶失活再进行连接反应（3）采用同聚物加尾连接技术线状DNA分子的两个3’-OH末端具有同样的碱基结构1.载体自身环化连接（能存活）2.载体之间互相连接（能存活）3.插入片段互相连接（不能存活）4.一个载体与几个插入片段重组（能存活）(五)载体和外源DNA插入片段的连接结果5.几个载体与一个插入片段重组（能存活）171.目的增加受体菌细胞膜的通透性。第二节重组体导入细菌细胞一、感受态大肠杆菌的制备什么是感受态？就是细菌吸收转化因子的生理状态。使用丧失了限制体系的大肠杆菌；具有与重组体互补的遗传性状；重组整合缺陷型。2.菌种用低渗CaCl2溶液在低温时处理快速生长的细菌，此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附在细菌表面，促进细胞对DNA的吸收。3.制备原理4.制备过程培养大肠杆菌OD600至0.3-0.4Onice30min4℃离心收集菌用冰冷的0.01MCaCl2重悬4℃离心收集菌分装、-70℃冻存Onice20min用冰冷的0.01MCaCl2重悬二、重组DNA导入大肠杆菌（1）转化（transformation)大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。（2）转染（transfection)大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。1.外源DNA导入细菌的几种方法（3）转导（transduction)借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。2.转化率每gDNA转化成功的细菌克隆数。3.DNA分子的转化过程①吸附:完整的双链DNA吸附在受体菌表面②转入:双链DNA分子解链单链DNA进入受体菌,另一链降解③自稳:单链DNA在细胞内复制成双链环状④表达:外源基因同复制子同时复制、转录、翻译4.转化方法简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。（1）热休克法（heatshock）转化效率高（高于109/gDNA）。（2）电转化法50ng载体DNA100L感受态菌Onice混合，静置30分钟42ºC90秒加入800LLB培养基37℃摇45min10-100L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA（1）热休克法LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟，2℃离心集菌冰冷的水重悬菌体2℃离心集菌冰冷的水重悬菌体2℃离心收集菌体少量冰冷的水重悬分装成50-300L电转仪调为2.5kV,25F脉冲控制器200-4000.5g质粒DNAOnice混合加入1mLSOC培养液37℃中速震荡60分钟10-100L转化液涂含抗菌素的平板转化（2）电转化法5.平板培养基培养细菌10-100L转化液涂于含抗菌素的平板37℃过夜环形重组质粒质粒自我连接线性载体或DNA片段进入细菌会被降解。①环形质粒数（1）重组质粒6.影响转化率的因素①生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。②必须在冰冷的条件下制备。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。④储存感受态菌要在-70℃以下③CaCl2处理⑤使用感受态菌时必须迅速融化融化后一般不能再次冻存使用。（2）感受态细胞（competentcells)把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。7.体外包装的噬菌体的转导（1）体外包装（invitropackaging）（2）转导（transduction）通过受体菌细胞表面的DNA接受器位点（receptorsite)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32℃下培养细菌时能够保持溶源性。但当温度升高到44℃—45℃时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。（3）cI857基因突变的噬菌体但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。cI857其它基因溶源状态（DNA不转录、不翻译）DNA阻遏蛋白阻遏蛋白44℃—45℃DNA转录、翻译合成外壳蛋白32℃噬菌体1外壳蛋白基因E发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。在cI857基因突变的噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型噬菌体。（4）互补型噬菌体外壳蛋白基因D发生了无义突变，不能合成头部的包装识别蛋白，但能合成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。噬菌体2(5)体外包装过程体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每gDNA能形成106噬菌斑）。（6）转导叶盘消毒切取土壤农杆菌浸泡看护培养基愈伤组织分化幼苗1.叶盘法（leafdisk）第三节外源基因导入植物细胞植物细胞原生质体纤维素酶和果胶酶DNA混合入电击缓冲液1-2kV,3-25F电击愈伤组织幼苗分化2.电击法（electroporation)又称高速微型子弹射击法（High-velocitymicroprojectiles)DNA1.2m金或钨弹头吸附特制手枪射击植物装入3.基因枪法（genegun）