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DNA的琼脂糖凝胶电泳酶切体系（µL）对照体系（µL）DDW1314Buffer22EcoRI10DNA441.酶切（1）酶切体系（2）37℃水浴40min2.琼脂糖凝胶电泳（注意：各组分加入顺序：DDW,Buffer,EcoRⅠ,DNA。）一、实验原理电泳（electrophoresis）是荷电溶质或粒子在电场作用下发生定向泳动的现象。电泳分离是利用荷电溶质在电场中泳动速度的差别进行分离的方法。根据其载体介质的不同可分醋酸纤维薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳等。核酸的分离和鉴定通常采用琼脂糖凝胶电泳。DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中通过琼脂糖凝胶向阳极移动。不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。TBE缓冲液，pH8.3DNA在电场中的迁移率的影响因素1）DNA的分子大小、形状、构象。2）琼脂糖的浓度。3）所加电压。4）嵌入的染料。5）电泳缓冲液的组成。琼脂糖凝胶电泳分离后的DNA可用溴化乙啶（EB）染色。溴化乙啶分子可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙啶检测DNA，可检出10-9g以上的DNA含量。琼脂糖凝胶电泳的优点1）琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（98%～99%），近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。2）琼脂糖呈透明状，无紫外吸收，电泳后的样品可直接用紫外检测；电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。3）操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。琼脂糖凝胶电泳的应用用于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等的电泳分离。现广泛应用于核酸的研究中。按相对分子质量大小分离DNA的凝胶电泳技术，是分析鉴定基因工程重组DNA分子的重要实验手段。是现在通用的许多分子生物学研究方法，如DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析等的技术基础，受到科学界的高度重视。二、试剂与器材电泳仪电泳槽缓冲液琼脂糖凝胶槽梳子取液器溴酚蓝试剂1、Tris-硼酸-EDTA缓冲液（TBE缓冲液），pH8.3：称取10.78gTris，5.50g硼酸，0.93gEDTA-Na2溶于去离子水，定容至1000mL。2、琼脂糖：1g溶于TBE缓冲液中加热配成100mL。3、0.05%溴酚蓝-50%甘油溶液（5×LoadingBuffer）：取一定量的0.1%溴酚蓝水溶液，与等体积甘油混合而成。4、0.5μg/mL溴化乙啶染色液：称取5mg溴化乙啶，用去离子水溶解，定容至100mL。从中取1mL，用无离子水稀释至100mL。（有毒，戴手套，通风柜内进行。）5、DNAMarkerDL2,000TMDNAMarker（TaKaRa公司）本Marker为已含有1×LoadingBuffer的DNA溶液可取5μL直接电泳6、大小未知的待测DNA溶液1、水平板型电泳槽2、直流稳压电泳仪3、微量移液枪4、凝胶成像系统：可发射紫外光，通过电脑进行凝胶图像的实时观测器材三、操作方法1、琼脂糖凝胶液的制备：称1g琼脂糖，置于三角烧瓶中，加入100mLTBE缓冲液，瓶口扣上一小烧杯，加热至微沸，琼脂全部融化。取出摇匀，即为1%琼脂糖。注意要完全融化混匀2、凝胶板的制备置水平板于工作台面上，将样品槽模板（梳子）插进水平板上凹槽内，距一端约0.5cm。梳子底边与水平板表面保持0.5-1mm的间隙。待琼脂糖冷至65℃左右，小心地倒入托盘内，使凝胶缓慢地展开在水平板表面形成一层约3mm厚均匀胶层。静置0.5小时。注意液内不存有气泡待凝固完全后，用滴管在梳齿附近加人少量缓冲液润湿凝胶，双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板，则在胶板上形成相互隔开的样品槽。将凝胶连同水平板放入电泳槽平台上。倒入TBE缓冲液直至浸没过凝胶面2-3mm。注意勿使样品槽破裂3、加样将待测DNA样品液与5×LoadingBuffer以4：1的体积比混合，用移液枪分别加人到凝胶板的加样槽内。每个糟加10μL左右。加样时，使样品集中沉于槽底部。DNAMarker取5μL直接进行加样。点样时应注意哪些问题？点样位置：靠近负极一端凝胶凹槽注意移液枪枪头不要损坏凝胶槽点样后在凹槽内移液枪不能倒吸点样后不能再移动电泳槽位置4、电泳加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极，接通电源，开始电泳。样品进胶后，应控制电压降不高于5V／cm(电压值V／电泳板两极之间距离比)。当溴酚蓝条带移动到距离凝胶前沿约lcm时，停止电泳。5、染色将电泳后的胶取出，小心推至溴乙锭染色液中，室温下浸泡染色30min。特别注意：溴化乙锭是DNA诱变剂和致癌物质，配制和使用EB染色液时，应戴乳胶手套，不要将该溶液洒在桌面或地面上。凡是沾污过溴化乙锭的器皿，必须经专门处理后，才能进行清洗或弃去。6、观察与拍照小心地取出凝胶置托盘上，并用水轻轻冲洗胶表面的溴化乙锭溶液，再将胶板推至凝胶成像系统的样品板上，在紫外灯下进行观察。DNA存在的位置呈现橘红色荧光，肉眼可观察到清晰的条带，拍照记录下电泳图谱。四、实验结果打印凝胶电泳图，贴于实验报告上，并对实验结果进行讨论，分析所测未知DNA的大小。五、课后研讨题1、总结本实验操作的关键环节和注意事项。2、实验所用DNA染料EB具有潜在的致癌性，查阅资料，查找可替代EB的染料并说明优缺点。3、查阅资料，举例说明DNA琼脂糖凝胶电泳的应用和发展。例如：普通琼脂凝胶电泳，很难分离大于50kb的DNA分子。如何研究超大片段DNA？