琼脂糖凝胶电泳检测dna

琼脂糖凝胶电泳检测DNA丁新伦[e-mail]13067206406【一】背景知识凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术；分离、鉴定和提纯核酸首选的标准方法。根据制备凝胶的材料:琼脂糖电泳凝胶电泳聚丙烯酰胺电泳【二】实验目的学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法检测碱裂解法提取质粒的结果检测双酶切法鉴定重组质粒的结果检测PCR法鉴定重组质粒的结果【三】实验原理（1）某物质在电场作用下的迁移速度叫做电泳的速率，电泳的速率与核酸分子大小和构型有关。DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，紧密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可以分离大小不同的DNA或RNA分子。（2）琼脂糖是一种线性多糖聚合物，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。（3）溴化乙锭为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可判断DNA分子量大小和粗略估计样品DNA浓度。•琼脂糖是一种线性多糖聚合物。•浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2【四】仪器、材料与试剂•质粒样品、酶切样品和PCR样品。•凝胶电泳系统和电泳图像分析系统(凝胶成像系统)等。•琼脂糖、1XTBE电泳缓冲液、溴化乙锭、6X载样缓冲液（6Xloadingbuffer）和DNA分子量标准（LambdaDNA/EcoRI+HindIIIMarker）等。凝胶电泳系统DYY-6C型双稳定时电泳仪电源（北京六一）输出范围（显示分辨率）：6-600V(1V)4-400mA(1mA)240W美国Bio-rad伯乐小型水平电泳槽Mini-SubCellGTCell凝胶成像分析系统LambdaDNA/EcoRI+HindIIIMarker（Ferments）一个已知分子质量的DNA样品做最对照，用来确定待测样品的相对分子质量。常用电泳缓冲液缓冲液缓冲容量迁移速度分辨率用途TAE最低最快(高10％)高分子量高高度复杂DNA混合物；超螺旋DNATBE很高较慢低分子量高价格昂贵，不常用TPE电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。作用：①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。③使样品呈色，使加样操作更方便。上样缓冲液溴化乙锭•溴化乙锭（3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐EthidiumBromide，EB），EB染色（EB可很好地掺入到双链DNA中），在紫外光下会发出橙红色的荧光，用于对DNA进行染色和观察。用于观察的紫外光有３种波长，一般使用中波紫外光（３０２ｎｍ）。短波紫外光（２５４ｎｍ）观察效果较好，但对DNA的破环很大。长波紫外光（３６６ｎｍ）：回收。•EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中或胶中。•EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。EB废液要经过处理才能丢弃。•SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，加入样品中，价格较昂贵。【五】实验步骤1.制备琼脂糖凝胶（1%）2.制备凝胶板3.加样4.电泳5.染色6.结果观察（1）制备凝胶和胶板：45ml(1×TBE)+0.4g琼脂糖（三角瓶），煮胶，溶解，冷却至60℃(不烫手)，倒板(4-6mm)，室温下充分凝固，竖直拔下梳子。胶板设计（44人）：•每18孔胶板（5人X3样品+1marker），8胶板•每8孔胶板（2人X3样品+1marker），2胶板（2）加样：5μl质粒DNA+1μlloadingbuffer，混匀15μlPCR产物+3μlloadingbuffer，混匀10μl酶切产物+2μlloadingbuffer，混匀6μlDNAMark（每板胶加一孔）（3）电泳：电压3-5V/cm，约80-90V，注意电极方向（4）染色：EB染色约15min（5）观察：紫外透射分析仪下观察。【六】实验结果