论文稿

1绪论植物在生长发育过程中，经常受到外界不良环境的影响，包括虫害、病菌等生物胁迫以及干旱、洪涝、盐碱、矿物质缺乏等非生物胁迫。经过长期进化，植物在应对这些外界刺激时，已经形成了区别于其他生物的多种抗逆机制，可以快速有效的感知并主动适应外界环境的刺激。这些机制主要是依靠植物体内逆境信号的快速传递，包括植物对逆境信号刺激的感受识别、逆境信号的转运运输以及效应部位对逆境信号的识别与转导等几个阶段。大量的实验研究表明，在细胞的信号识别与转导过程中，蛋白质的可逆磷酸化发挥了重要的作用。细胞中蛋白质可逆磷酸化（reversibleproteinphosphoryIation）是由蛋白激酶和蛋白磷酸酶这一对酶共同协作完成的，包括蛋白质的磷酸化与去磷酸化两个主要翻译后反应。蛋白磷酸化几乎参与了细胞的分裂、糖代谢、基因表达调控及光合作用等所有的生理和病理过程，是普遍存在的一种调节机制。1.1MAPK级联途径促分裂原活化蛋白质激酶（Mitogen-activatedproteinkinase,MAPK）广泛存在于真核生物中，进化保守，含有11个保守的亚结构域，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonineprotease）的一个大家族，在生物体中，与其他信号分子一起组成促分裂原活化蛋白质激酶级联参与调节特异基因表达、有丝分裂、新陈代谢以及细胞程序性死亡等细胞内活动。促分裂原活化蛋白激酶级联途径（Mitogen-activatedproteinkinasecascade,MAPKcascade）是由促分裂原活化蛋白激酶MAPK（MPK）、促分裂原活化蛋白激酶的激酶MAPKK（MKK）、促分裂原活化蛋白激酶的激酶之激酶MAPKKK（MEK）三种激酶构成的，即MAPKKK-MAPKK-MAPK信号级联放大途径，通过蛋白磷酸化作用将外界信号分子传递到细胞内，引起胞内相应的变化。这种信号传导模式在真核生物中属于进化上相对保守的。在受到外界刺激的信号分子时，Ras/Rho家族中的小GTP结合蛋白磷酸化MAPKKK（MEK）而激活其活性，被活化的MEK通过磷酸化MAPKK（MKK）保守结构域中的Ser/Thr氨酸残基而激活MKK，活化的MKK接着磷酸化MAPK第Ⅶ和第Ⅷ亚结构域之间Ser/Thr和Tyr残基而激活MPK。被激活的MPK有两条途径，其一是进入细胞核，激活特定的转录因子从而调控相应功能基因的表达，其二是留在细胞质里，作为中间物质将信号传递给下游底物，从而引起细胞内应对外界刺激的应答反应。在动物中，MAPK级联途径与细胞内的基因表达、细胞增殖、死亡等生命活动密切相关。目前，已发现的主要有4条MAPK途径：（1）ERK途径，细胞外信号调节激酶（extracellularsignal-regulatedkinase,ERK）是目前研究最为清楚的MAPK，构成了最有代表性的信号通路Raf-MEK-ERK；（2）JNK途径，c-Jun氨基末端激酶（c-JunN-terminalkinase，JNK）进化上十分保守，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于促MAPK超家族成员之一，JNK级联反应是由MKKK、MKK以及JNKMAPK三个家族成员协同作用；（3）p38途径，蛋白激酶MKK3和MKK6可以磷酸化p38的同分异构体，从而达到活化的目的，由PAK(p21activatedkinase,MAPKKKK)、MLK(MAPKKK、MKKK或MEKK)、MKK3/6/4(MAPKK、MKK或MEK)、p38MAPK(MAPK)这4种激酶构成了p38MAPK级联途径；（4）ERK5途径，ERK5可以通过磷酸化和C端的物理性结合作用来激活底物，构成了MAPKKK（MEKK3或MEKK2）-MAPKK（MKK5）-ERK5级联途径。在植物中，MAPK级联途径的研究要比酵母和动物中稍晚，植物方面的研究是从20世纪90年代第一个植物MAPK激酶基因分离鉴定出来后才发展起来的，目前已经陆续从拟南芥、水稻、烟草、二穗短柄草等多种植物中分离得到了许多蛋白激酶，根据其底物蛋白被磷酸化的氨基酸残基种类，可以将他们分为不同5类：（1）丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶；（2）组氨酸蛋白激酶；（3）色氨酸蛋白激酶；（4）酪氨酸蛋白激酶；（5）天冬氨酰基/谷氨酰基蛋白激酶。目前已经从植物中分离得到的蛋白激酶主要是前三类。现在研究比较多的主要有促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activatedproteinkinase,MAPK）、钙依赖而钙调素不依赖的蛋白激酶（Calciumdependenceandcalmodulinnotdependentproteinkinase,CDPK）、蔗糖不发酵相关蛋白激酶（Sucrosenon-fermenting-1-relatedproteinkinase,SnRK）等。大量的研究表明，植物MAPK级联途径在生长发育和抗逆响应等生理生化过程中起着十分重要的作用。MAP激酶级联途径在植物信号传导过程中的作用受到了广泛的重视。MAPKs基于序列分析对比，根据植物中MAPKs保守的TXY氨基酸序列的不同，可将其分成TEY和TDY2个亚型，可以被它们分为A、B、C和D四个组，其中A、B、C属于前者TEY亚组，D属于后者。他们都参与了环境胁迫的应答反应。近年来，大多已知基因的分子鉴定都集中于A、B两个亚组，在这两个亚族的激活区有一个TEY磷酸化序列。A亚族中已被研究鉴定的具有代表性的基因有AtMAPK3、AtMAPK6、NtSIMK、NtSIPK、NtWIPK，研究发现它们可以被一些环境胁迫激活，在多种生物和非生物胁迫中起着十分重要的作用。研究发现B亚族同时参与了抗病，比如AtMAPK4、MsMMK2、MsMMK3，和非生物胁迫的响应，比如AtMAPK4。目前关于C亚族，除了应对于环境压力的OsMAPK4还有参与植物昼夜节律调节表达的AtMAPK7，其他基因的研究相对比较少。D亚族MAPKs是TDY序列，但是缺少具有结合MAPKKs位点的CD区。这些亚族的功能仅在少数的例子中被提及。例如，OsBWMK1会被病原菌刺激所诱导，OsWJUMK1在受到各种环境压力等刺激时，会被调节表达。目前，我们已经成功从油菜中分离得到BnMPK3和BnMPK9两种MAPK基因。它们分别属于A、D两个亚族，据推测，它们可能参与了植物响应环境胁迫的过程。MAPKKs植物中的MAPKK基因数较少，目前已经被分子鉴定的少于30个，但是根据其氨基酸序列的保守性，可以将它们分为A、B、C和D四个亚组。植物MKKs的磷酸化位点不同于动物，它们都有一段相同的磷酸化位点序列S/T-X5-S/T，以及在N端有一段K/R-K/R-K/R-Xl-6-L-X-L/V/I结构域作为MAPK的锚定位点。目前只有A、C类的MKKs被证明会被各种非生物胁迫激活，如AtMKK1、MsPRKK，还会被病原菌或者病原菌类似的化学刺激所诱导，如MsPRKK、NtMEK2、AtMKK4和AtMKK5。NtMEK1可以激活与细胞周期调控蛋白p43有关的MAPK基因Ntf6。而B、D类的MKKs尚没有研究证明其有任何功能。MAPKKK相对于MAPKs和MKKs，植物中的MAPKKK是MAPK信号途径组成中最庞大也是最复杂的家族。拟南芥中已经发现了80个MAPKKK基因，按照其保守的氨基酸序列，可以将它们分为MEKK类、Raf类和ZIK类等三个亚类。拟南芥中MEKK亚类和哺乳动物中的MEKK1相似，在它的21个成员中，AtMEKK1和AtMEKK4-like基因参与植物的渗透、机械损伤、抗病反应。NPK1和AtMAP3Kε-1相关的蛋白激酶可能在细胞分裂中起着重要作用。拟南芥中ZIK-like蛋白激酶有11个家族成员，其中AtZIK蛋白WNK1是调控昼夜节律的一个蛋白。拟南芥Raf-like亚类包含了48个成员，含有相当保守的蛋白激酶结构域，包括AtCTR1、AtEDR1和ATN1-like等蛋白。1.2植物体中的MAPK1.2.1MAPK结构特点植物中的MAPKs分子量大多在38~55KD之间，都含有一个由300多个氨基酸组成的催化区域。根据催化区域氨基酸序列同源性高低，可分成11个亚结构域，在第Ⅶ和第Ⅷ亚结构域之间，存在一个三肽基，由苏氨酸（T）、一个X氨基酸（X是谷氨酸、脯氨酸或甘氨酸）和酪氨酸（Y）和组成的T-X-Y区（Loop12环状结构，也称为三肽模块），它是MAPK的磷酸化过程中ATP磷酸化的位点。T环是一个接近磷酸活化位点的表面环状结构，又被形象的称为“磷酸化唇”或者“激活唇”，在调节各种MAPK激酶的活性状态中起重要作用。不同的MAPK亚族成员除了X氨基酸不同之外，所包含的L12长度也从25到38个氨基酸不等。L12环状结构中的L12的长度在控制自主磷酸化上有重要作用，并且X残基和L12的长度均能影响MAPK的底物特异性[2]。随着X衍射和双向电泳、质谱等技术手段的不断发展，MAPK被磷酸化的具体作用机制逐渐被认识和熟知。植物MAPKs除了具有同源性很高的催化区外，都还有一个调节区。催化亚基和调节亚基构成四聚体结构组成没有活性的蛋白激酶全酶。当调节因子与调节区结合后，就把催化区暴露或游离出来，用来磷酸化底物。此外，游离在细胞质中的催化亚基还可以转移进入到细胞核中，以调节相应的特定基因的表达。MAPKs未被激活时，催化位点是被磷酸唇封闭的，当激活剂与其结合作用后，磷酸唇结构变得不稳定，从而使酪氨酸催化位点暴露出来并被磷酸化，被磷酸化的氨基酸又与未被激活的氨基酸相互作用，于是磷酸唇的形状被改变，ATP结合到催化位点上。磷酸化作用不仅能激活MAPK的活性，还有助于其二聚体的形成，促使MAPK进入细胞核，调控有关转录因子的活性，从而调控相关基因的表达[3]。1.2.2植物中MAPK的分类随着基因组测序技术的发展，拟南芥、水稻、烟草、小麦等植物序列已陆续被测序完成。目前，已经分离克隆出许多植物MAPK基因，大概有50多种，比如烟草中的Ntf3、Ntf4、Ntf6、水稻中的OsBIMK1基因以及拟南芥中21种MAPK等。根据他们T-X-Y三肽模块中氨基酸残基的序列对比，可将其分为TEY和TDY两个型。其中前者TEY可分为A、B、C三个组，后者TDY则为D组。A、B组MAPK蛋白在C端都含有一个可能作为上游激酶、磷酸酶、下游底物的停靠位点的保守区域，被称为CD区。C组的CD区据推测可以被修饰，具体功能尚不清楚，而D组中没有发现CD区。各个组中的MAPK的功能也不一样。A组的MAPK主要参与多种环境胁迫以及激素反应，例如，在逆境下MPK3基因会被快速诱导表达，在氧胁迫下MPK3蛋白又会被激活；紫花苜蓿中的SIMK参与低温、干旱、机械损伤等胁迫响应[5]；关于B组MAPK成员相对研究较少，但有实验研究表明它们参与响应了逆境胁迫和细胞分裂反应，例如，在拟南芥中，AtMKK3主要参与由病原菌引发的依赖于茉莉酸信号通路的信号传递途径[6]；目前，关于C组中的MAPK的研究很少，但是已经研究发现了拟南芥AtMAPK7的表达对昼夜生理节律起着重要作用[7]；D组MAPK结构与A、B、C组都存在明显的差异，目前关于D组的研究报道很少，需进以后进行更多的研究。1.2.3植物中MAPK的功能作为MAPK的研究模型，酵母细胞中一共发现了6个MAPK基因，现已被阐明的5个MAPK基因在酵母有性生殖、芽孢形成等过程中起着十分重要的作用。在哺乳动物中，研究发现MAPK基因在激素等信号传递过程中起着关键作用。随着对植物MAPK基因的关注越来越多，植物体中MAPK的功能也被了解的越多越全面。MAPK在植物激素信号传导中的作用植物激素是指在特定环境信号诱导时植物细胞自身代谢产生的一类有机物质。很多激素以信号分子的形式作用于细胞，并通过MAPK信号通路进行传递，从而影响植物的整个生长、发育和分化的过程。脱落酸(abscisicacid，ABA)是一种抑制生长的植物激素，因能促使叶子脱落而得名。具有促进脱落、抑制生长、促进休眠、调节种子萌发