DNA的琼脂糖凝胶电泳分析

DNA的琼脂糖凝胶电泳分析制作小组：杜金红王成强汪强实验目的掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理和方法实验原理：琼脂糖凝胶电泳1、琼脂糖凝胶：天然琼脂是一种多聚糖，主要由琼脂糖及琼脂胶组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些集团带有点荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象。2、DNA的琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用与核酸的分子量、分子构型和凝胶浓度密切相关。（1）DNA的分子大小实验证明，DNA片段迁移距离与其分子量的对数成反比。通过比较标准物与未知片段的移动距离便可测出未知片段的大小。但当DNA分子超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难讲它们分开。（2）核酸构型不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大。在分子量相当的情况下，不同构型的质粒DNA的移动速度次序为：共价闭环DNA＞直线DNA＞开环的双链环状DNA。这三种构型的相对迁移速率主要取决于凝胶浓度，同时也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。（3）琼脂糖的浓度一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的电泳迁移率不同。要有效地分离大小不同的DNA片段，需选用适当的琼脂糖凝胶浓度。不同浓度的琼脂糖凝胶适宜分离的DNA片段大小范围见表。琼脂糖凝胶浓度（％）0.30.60.70.91.21.52.0可分辨的线性DNA大小范围（kb）60~520~110~0.87~0.76~0.44~0.23~0.13、DNA分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应，但主要是分子筛效应。在pH8.0~8.3时，核酸分子剪辑几乎不解离，磷酸解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。4、溴化乙锭（EB）是一种吖啶类染料，它在紫外灯照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的DNA。跑出好看的电泳图：凝胶一定要加热熔解完全，均匀，可以对着光亮的地方看看清澈不清澈；一般情况下，梳子越薄而长，条带越好看；上样量不宜过多，会造成条带的相互挤压；如果点样孔多余，将样点到中间，尽量避免边缘效应，中间电场比较均匀；做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该一致；加样时不要太快，让其自然沉底，均匀分布在电泳孔内；电泳开始时可以采用低电压使其跑出孔后，再调高电压。实验器材与试剂（一）器材：电泳槽电泳仪微波炉（二）试剂1、6×上样缓冲液：0.25％溴酚蓝；0.25％二甲苯青；30％甘油水溶液。（由甘油、溴酚蓝指示剂以及DNA稳定剂按一定比例混合而成，经去核酸酶处理，适用于DNA样品的电泳检测，在自然光线下呈现暗红色，与核酸样品混合后，受样品pH值的影响，通常变为蓝紫色。其中的溴酚蓝在不同浓度琼脂糖凝胶和不同电泳缓冲液中的迁移率不同，其迁移位置可作为DNA条带电泳位置的参照物。）加样缓冲液可以增大样品密度，以确保DNA均匀进入样品孔内，还可以使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利。溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍,溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约与长300bp的双链线性DNA相同,而二甲苯青FF在琼脂糖凝胶中移动的速率则与4kb双链线性DNA相同。2、50×TAE电泳缓冲液：称取242gTris碱（即三羟甲基氨基甲烷，Tris为弱碱，在室温（25℃）下，它的pKa为8.1；根据缓冲理论，Tris缓冲液的有效缓冲范围在pH7.0到9.2之间。Tris碱的水溶液pH在10.5左右，一般加入盐酸以调节pH值至所需值，即可获得该pH值的缓冲液。但同时应注意温度对于Tris的pKa的影响），，加H2O800ml，待完全溶解后，加57.1ml冰乙酸，100ml0.5mol/LEDAT（pH8.0），用H2O定容至1000ml。临用前用H2O稀释成1×TAE电泳缓冲液。3、琼脂糖4、溴化乙锭（EB）10mg/ml：取EB0.10g完全溶解100ml水中，避光室温保存。5、DNA分子量标准品实验操作1、制备琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖粉，放入锥形瓶中，加入100ml×TAE电泳缓冲液，置微波炉或水浴内加热熔化，取出摇匀即为1％琼脂糖凝胶液。待凝胶液冷却至60℃后加入溴化乙锭5ul，使其终浓度为0.5ul/ml。2、胶板的制备：在制胶槽内插入样品梳，将凝胶液倒入制胶槽中。待胶凝固后，取出梳子，将内槽放入电泳槽内。加入1×TAE电泳缓冲液至电泳槽中，使其没过凝胶表面1~2mm。梳板的选用一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板，梳齿宽厚，形成的点样容积较大，用于DNA片段回收实验等；相反，梳齿窄而薄，形成的点样容积就较小，用于PCR产物、酶切产物鉴定等。一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。3、加样：用移液器将质粒DNA3ul与6×上样缓冲液1ul混匀后加入加样孔，记录点样顺序。（注意：家央视需将枪头深入加样孔内再吹出样品，以免样品从凝胶表面扩散；加样时枪头不要刺穿或碰坏凝胶孔壁，否则将导致样品将从凝胶底部扩散或DNA带型不整齐。）4、电泳：接通电泳槽与电泳仪之间的电源（注意正负极，切记DNA样品由负极往正极泳动，即靠近加样孔德一端应为负极）。调节电压值5V/cm，开始电泳。当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处，停止电泳。5、实验结果的观察：在紫外透射仪上观察电泳带及其位置，DNA存在处应显出桔红色荧光条带注意事项1、倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃，否则温度太高会使制胶板变形。2、胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要垂直向上，不要弄坏点样孔。3、点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，不要刺穿点样孔。4、配胶和灌电泳槽需使用同一批缓冲液。因为pH或离子强度很小的差别也会在凝胶前部造成紊乱，影响DNA片段的泳动。5、溴化乙锭见光易分解，应储存在棕色瓶中于4℃条件下保存。溴化乙锭在紫外灯下放置时间过长，荧光会猝灭。6、溴化乙锭是强致突变剂，操作中切勿用手接触，应戴一次性手套操作，避免污染试验台面。（致突变作用：污染物或其他环境因素引起生物体细胞遗传信息发生突然改变的作用。这种变化的遗传信息或遗传物质在细胞分裂繁殖过程中能够传递给子代细胞，使其具有新的遗传特性。具有这种致突变作用的物质，称为致突变物或称诱变剂。）