引物设计教程

PCR引物设计及相关软件使用主要内容背景PCR引物设计原则常用PCR引物设计软件PrimerPremier5.0介绍Oligo6.22介绍在线Primer3介绍PCR聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。PCR引物设计引物设计是PCR技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。引物设计的原则引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。如引物长度（primerlength），产物长度（productlength），序列Tm值(meltingtemperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internalstability,用∆G值反映)，形成引物二聚体(primerdimer)及发夹结构（duplexformationandhairpin）的能值，在错配位点（falseprimingsite）的引发效率，引物及产物的GC含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。具体因素一般原则引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-24bp，但不应大于38。引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3x109/412=200).而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个.较长的引物（28-35bp)一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点Tm值的计算一般的公式Tm=4(G+C)+2(A+T)对于长一些的引物可用更为准确的nearest-neighbor（Frieretal.(1986)）一般原则2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。一般原则3，引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。一般原则4.引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。不同的算法推荐45-55%或50-60%一般原则5.∆G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端∆G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间∆G值相对较高的引物。引物的3’端的∆G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。（能值越高越容易结合）一般原则6.对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。一般原则7.引物二级结构对PCR反应的影响。尽可能少的引物二聚体。常用的引物设计软件Oligo6（引物评价）*PrimerPremier（自动搜索）*VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3（在线服务）*PrimerPremier5.0的使用技巧简介主要功能:1、即引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析简并引物设计根据氨基酸序列来设计引物DNA引物PremierPrimer5提供了8种生物遗传密码使用的偏好选择1、纤毛虫大核（CiliateMacronuclear）2、无脊椎动物线粒体（InvertebrateMitochondrion）3、支原体（Mycoplasma）4、植物线粒体（PlantMitochondrion）5、原生动物线粒体（ProtozoanMitochondrion）6、一般标准（Standard）7、脊椎动物线粒体（VertebrateMitochondrion）8、酵母线粒体（YeastMitochondrion）PrimerPremier5.0使用介绍(1)PreimerPremier启动界面Loadsequence基本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8种密码子偏好Chooseafunction引物设计界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer引物搜索选项设定引物类型搜索模式5’引物位置范围3’引物位置范围产物大小范围引物长度搜索结果28对引物引物分值100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有But…引物编辑引物编辑EditprimerhereAnalysistheeditresultAccepttheeditresultReturntothemainwindowSomeotherusefulfunctionofPP5EnzymeMeltingtemperaturegraphPer25-merGC%graphPer25-merStabilityPer5-merOligo6.44使用说明主要功能：专门的引物设计软件Oligo6.44启动界面Opensequencefile3个弹出窗口Meltingtemperature∆GInternalStabilityFrq为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。用Oligo设计引物时的3个标准Tm值曲线以选取5’到3’的下降形状有利于引物引发聚合反应。Frq曲线宜选用3’端Frq值相对较低的片段。ΔG值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低选中引物上游引物下游引物只是示意图引物分析首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。引物分析二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。引物分析第三项检查为GC含量，以45-55％为宜。第四Falsepriming检查引物分析KeyinformationofprimerHairpinDimerandcrossDimerGC%TotalPCRinformationFinalPCRinformationSearchforprimerusingOligo6.44SearchprimerOnlineprimer3service引物设计及相关软件使用主要内容PCR介绍引物设计原理引物设计的优化原则PrimerPremier5.0介绍举例说明引物的设计PCR介绍1、什么是PCR2、PCR的组成3、如何提高PCR成功率（定量，对照）引物设计原理引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物设计总体上包含三个程序：序列下载，同源性比较，引物设计筛选。引物设计的原则1、引物长度大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。如果期待的产物长度等于或小于500bp，选用短的(16～18)的引物；若产物长5kb，则用24个核苷酸的引物。有人用20～23个核苷酸引物得到40kb的产物。引物设计的原则2、引物GC含量GC含量在40%－60%之间，以45-55％为宜。这可为有效退火提供足够热。引物设计的原则3、引物Tm引物所对应模板序列的Tm值最好72℃左右。至少要在55－80℃之间。Tm=2(A+T)+4(C+G)引物设计的原则4、引物3’端引物3’末端和模板的碱基完全配对防止一对引物内的同源性考虑末端5个碱基的ΔG引物3′端要避开密码子的第3位引物设计的原则5、引物序列与模板序列组成的相似性可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高。引物设计的原则6、最好在模板cDNA的保守区内设计DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。引物设计的原则7、引物自身及引物之间不应存在互补序列引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物设计的原则8、碱基要随机分布引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。引物设计的原则9、引物应具有特异性引物设计完成以后，应对其进行检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。引物设计的原则10、ΔG值ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。引物设计的原则11、引物的5′端引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰，引物5′端修饰包括：加酶切位点、标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物设计的原则12、在DNA测序和PCR中最好用5′末端稳定(如GC含量较多)，而3′末端不太稳定(如AT含量较多)的引物PrimerPremier5.0简介主要功能:1、即引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析PrimerPremier5.0使用介绍PreimerPremier启动界面Loadsequence基本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8种密码子偏好Chooseafunction引物设计界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer引物搜索选项设定引物类型搜索模式5’引物位置范围3’引物位置范围产物大小范围引物长度搜索结果28对引物引物分值100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有But…引物编辑引物编辑EditprimerhereAnalysistheeditresultAccepttheeditresultRe