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泛素特异性蛋白酶46（ubiquitin-specificprotease46,USP46）研究进展一.真核细胞内蛋白质的降解途径介绍•溶酶体途径---非特异性的蛋白质降解系统，真核细胞内90%以上的长寿蛋白和一部分短寿命蛋白都是在溶酶体中降解的。•泛素-蛋白酶体途径---是真核细胞中具高效和高度选择性的特异性降解蛋白质的重要途径，广泛参与机体多种代谢活动。•胱天蛋白酶(caspase)途径---蛋白酶以酶原的形式存在于正常细胞中，细胞凋亡启动后被激活。泛素-蛋白酶体系统•由泛素、泛素化酶（包括泛素活化酶E1、泛素偶联酶E2、泛素连接酶E3）、蛋白酶体和去泛素化酶组成。•泛素化酶为底物蛋白加上泛素标签，泛素化的蛋白质被运送到蛋白酶体降解。•蛋白质的泛素化是一个可逆的过程，去泛素化酶通过对底物蛋白的去泛素化来调控蛋白质的寿命。二.蛋白质泛素化与去泛素化介绍•泛素是一个含76个氨基酸在结构和序列上都高度保守的蛋白质分子，分子量大概8.5kDa。•蛋白质的泛素化修饰是一种广泛存在且非常重要的蛋白质翻译后修饰。•调控许多生物学功能包括细胞周期、细胞凋亡、DNA损伤修复、细胞免疫以及神经元退化等方面都发挥着重要作用。1.蛋白质的泛素化修饰是一个泛素分子(ubiquitin)通过其羧基端结合到目的蛋白赖氨酸(Lys,K)上的共价反应过程。泛素本身有7个赖氨酸残基位点，分别是K6、K11、K27、K29、K33、K48以及K63位，并且泛素本身的赖氨酸残基也可以再与泛素分子相互结合。二.蛋白质泛素化与去泛素化介绍1.蛋白质的泛素化修饰•首先,在E1催化下泛素的羧基端与E1的半胱氨酸激活位点以硫酯键结合,此过程需要ATP;•其次,泛素被转运到E2的半胱氨酸残基,同样是以硫酯键的形式接合;•最后,在E3的作用下,泛素的羧基端与底物蛋白的赖氨酸-ε氨基基团之间形成肽键从而将泛素转移到底物蛋白上。•E3具底物特异性二.蛋白质泛素化与去泛素化介绍1.蛋白质的泛素化修饰步骤=HIGH二.蛋白质泛素化与去泛素化介绍蛋白质的泛素化修饰与衰老去泛素化酶在维持游离泛素和泛素结合蛋白的动态平衡中发挥着重要作用。细胞内广泛存在多种去泛素化酶，按结构不同分为5种类型。包括•泛素特异性蛋白酶（USPs）•泛素羧基末端水解酶（UCHs）•Machado-Josephdiseaseproteindomainproteases（MJDs），•卵巢肿瘤相关蛋白酶（OTUs）•MPN（+）/JAMM蛋白酶（JAMMs）泛素特异性蛋白酶（USPs）是去泛素化酶中成员最多，且结构最具多样性的一类。二.蛋白质泛素化与去泛素化介绍2.蛋白质的去泛素化修饰二.蛋白质泛素化与去泛素化介绍2.蛋白质的去泛素化修饰（1）亲核体如谷胱甘肽上泛素解离（2）泛素加合到细胞内其他蛋白上（3）降解蛋白泛素寡聚体循环利用（4）未锚定泛素寡聚体的解离AlexanderY,etal.BiochimicaetBiophysicaActa2004,(1695)189–2073.去泛素化酶USP蛋白家族介绍二.蛋白质泛素化与去泛素化介绍•含有两个短的高度保守的序列，称为Cys结构域和His结构域•序列中具有起催化作用的三联残基，即半胱氨酸、组氨酸、天冬氨酸/天冬酰胺，能将泛素分子从大的蛋白上移除。V.Quesadaetal.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2004,314:54–62Multi-tissueexpressionofUsp46mRNAinRattusnorvegicus3.泛素特异性蛋白酶USP46介绍二.蛋白质泛素化与去泛素化介绍WeiZhang，etal.PLoSONE,2011,6(10),e26297.USP46调控抑郁usp46为悬尾试验（TailSuspensionTest，TST）和强迫游泳试验（ForcedSwimmingTest，FST）中调节小鼠不动行为的数量性状基因。CS和B6.CSNgu1053鼠在TST和FST实验中不动时间明显更短ShigeruTomida,etal.naturegenetics,2009,41(6):688-695.ShigeruTomida,etal.naturegenetics,2009,41(6):688-695.USP46调控抑郁CS小鼠Usp46第92号赖氨酸缺失是造成小鼠不动时间短于C57BL/6J小鼠的主要原因CS鼠5号染色体上Usp46基因有编码一个赖氨酸的3个碱基缺失ShigeruTomida,etal.naturegenetics,2009,41(6):688-695.USP46调控抑郁细菌人工染色体Usp46转基因鼠可以逆转CS鼠的抗抑郁状态Usp46第92号赖氨酸缺失导致酶活下调WeiZhang,etal.PLoSONE,2011,6(10),e26297.USP46基因标签SNP的单倍型与重度抑郁症相关FukuoY,etal.Journalofaffectivedisorders,2011,133(1-2):150-157.ThedeubiquitinationenzymeUSP46functionsasatumorsuppressorbycontrollingPHLPP-dependentattenuationofAktsignalingincoloncancer去泛素化酶USP46通过控制PHLPP依赖性的Akt信号通路而抑制结肠癌症读书报告：XinLi,etal.Oncogene.2013January24;32(4):471–478.报告人：林万华时间：2013年11月16日三.去泛素化酶USP46通过控制PHLPP依赖性的Akt信号通路而抑制结肠癌症1.细胞内PHLPP与USP46特异性相互作用A.HA-PHLPP1分别与USP46、USP7、USP16共转染293T细胞，USP蛋白带有Flag和HA标签，anti-Flag琼脂糖免疫共沉淀。(Flag抗体拉USP,USP拉PHLPP1，结果只有USP46拉下了PHLPP1，而USP7和USP16没有拉下PHLPP1，说明只有USP46与PHLPP1作用)。同样，只有USP46与PHLPP2相互作用。B.在DLD1细胞中，内源性的USP46可与内源性的PHLPP1、2相互作用。293T细胞中，GST,GST-PHLPP1，GST-PHLPP2片段拉USP46，只有PHLPP蛋白的C端与USP46相互作用。三.去泛素化酶USP46通过控制PHLPP依赖性的Akt信号通路而抑制结肠癌症1.细胞内PHLPP与USP46特异性相互作用D.USP46与PHLPP相互作用的最小作用区段是C端的1139-1172，PHLPP1与PHLPP2的1139-1172区段是保守的E.同样，在PHLPP2中，也是这个保守区段1268-1301与USP46相互作用。三.去泛素化酶USP46通过控制PHLPP依赖性的Akt信号通路而抑制结肠癌症1.细胞内PHLPP与USP46特异性相互作用Fig.2Aand2B：在HCT116细胞中，超表达WTUSP46可以显著提高PHLPP的蛋白水平，其效应是减少了70%的Akt磷酸化水平。将USP46催化区段Cys突变为Ser后，突变体USP46则失去了调控PHLPP表达水平和Akt磷酸化水平能力。三.去泛素化酶USP46通过控制PHLPP依赖性的Akt信号通路而抑制结肠癌症2.USP46调控PHLPP的表达水平在HCT116细胞中，野生型USP46可以上调PHLPP1的表达水平，而Δ1139突变体和USP46-C44S没有效应(Fig.2C)失去了磷酸化位点的PHLPP1-4A突变体，由于有抗泛素化降解作用而使其蛋白水平远远高于WTPHLPP1。USP46不能进一步提高PHLPP1-4A突变体的表达水平，表明USP46通过去泛素化来提高PHLPP蛋白的表达三.去泛素化酶USP46通过控制PHLPP依赖性的Akt信号通路而抑制结肠癌症2.USP46调控PHLPP的表达水平USP46敲低后，PHLPP降解大大加快。PHLPP1和PHLPP2的半衰期分别由4.6h降为2.3h，和6.1h降为3.3h(Fig.2Fand2G)。三.去泛素化酶USP46通过控制PHLPP依赖性的Akt信号通路而抑制结肠癌症2.USP46调控PHLPP的表达水平体外检测，经WTUSP46处理后，PHLPP1的泛素化水平下降，但USP46-C44S突变体无此效应(Fig.3A)经MG-132(蛋白酶抑制剂)处理后提取蛋白样品检测，发现超表达WTUSP46显著下调PHLPP1的泛素化水平，而USP46-C44S突变体无此效应(Figure3B)。三.去泛素化酶USP46通过控制PHLPP依赖性的Akt信号通路而抑制结肠癌症3.USP46直接调控PHLPP1的泛素化USP46敲低后PHLPP1的泛素化水平显著上升(Fig.3C，3D)。三.去泛素化酶USP46通过控制PHLPP依赖性的Akt信号通路而抑制结肠癌症3.USP46直接调控PHLPP1的泛素化当仅超表达PHLPP1时，Akt的去磷酸化水随PHLPP1的表达增加而下调。然而，Akt的去磷酸化程度很低(Fig.4A,lanes1-4)。共表达USP46和PHLPP1可以很显著地下调PHLPP1作用的Akt去磷酸化，因为USP46可以稳定PHLPP1蛋白水平(Fig.4A,lanes5-6)。三.去泛素化酶USP46通过控制PHLPP依赖性的Akt信号通路而抑制结肠癌症4.USP46可以增强PHLPP的Akt去磷酸化能力在测定PHLPP1和USP46基因对HCT116细胞增殖的影响时，我们发现Akt的磷酸化水平与细胞增殖速率密切相关(Fig.4B)。超表达PHLPP1可以剂量性的抑制细胞增殖，USP46共表达则可以增强这个效应(Fig.4B)。三.去泛素化酶USP46通过控制PHLPP依赖性的Akt信号通路而抑制结肠癌症4.USP46可以增强PHLPP的Akt去磷酸化能力,抑制细胞增殖敲低USP46可以提高Akt的磷酸化水平，敲低USP46后WTPHLPP1的Akt去磷酸化能力大大下降，而抗泛素化的PHLPP1-4A的Akt去磷酸化能力不变(Fig.4C)。在敲低USP46的细胞内，PHLPP1很难抑制细胞增殖(Fig.4D)。三.去泛素化酶USP46通过控制PHLPP依赖性的Akt信号通路而抑制结肠癌症4.USP46可以增强PHLPP的Akt去磷酸化能力,抑制细胞增殖构建载体、USP46、PHLPP1、及共表达PHLPP1和USP464种HCT116细胞稳定株。将细胞株注射入裸鼠皮下，观察其后32天的成瘤性。如图A所示，参照组细胞能有效的成瘤，到实验结束时瘤体积达到1600mm3，超表达USP46后瘤体积明显减小，但差异不显著。而超表达PHLPP1则显著减小瘤体积。共表达USP46则可显著提高PHLPP1的抑瘤能力。可从分离的瘤内检测到PHLPP1和USP46的表达。在超表达USP46的细胞中PHLPP1的表达增加，而Akt磷酸化水平下降(Fig.5B)。三.去泛素化酶USP46通过控制PHLPP依赖性的Akt信号通路而抑制结肠癌症5.USP46增强PHLPP1肿瘤抑制能力以Ki67免疫染色了肿瘤组织，发现超表达USP46,PHLPP1,或USP46plusPHLPP1的Ki-67阳性细胞大大减少，共表达USP46和PHLPP1的抑制效果最为明显(Fig.5C，Fig.5D)。三.去泛素化酶USP46通过控制PHLPP依赖性的Akt信号通路而抑制结肠癌症5.USP46增强PHLPP1肿瘤抑制能力PHLPP1和USP46在11种结肠癌细胞系中的表达情况