基因重组-PowerPointPresentation

DNA重组技术DNA重组技术前言一、重组DNA技术的诞生（一）重组DNA技术诞生的理论基础1.40年代明确了遗传的物质基础是DNA肺炎链球菌2、50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制3、50年代末和60年代提出了“中心法则”和操纵子学说，并成功地破译了遗传密码。中心法则遗传密码64个密码子61个代表各种氨基酸（AUG起始密码）3个密码子为终止子（UAA、UAG、UGA）操纵子(operon)用基因表达调控的原理解释了酶诱导的本质。（二）关键性实验技术问世为重组DNA技术奠定基础1.DNA分子的切割与连接技术2.载体构建和大肠杆菌转化体系的建立3.Southern杂交、DNA序列分析和聚合酶链式反应二.重组DNA技术的定义及步骤（一）重组DNA技术1、重组DNA技术（recombinantDNAtechnology):按照人的意愿，在体外对DNA分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝，表达相关基因的产物，是进行基因功能研究的基本方法。2.克隆（clone):指由一个细胞通过无性繁殖以后形成的与亲代完全相同的子代群体。分子克隆（molecularcloning）：构建DNA重组体并导入宿主细胞建立无性繁殖体系。（二）重组DNA技术的重大意义1.填平了生物种属间不可逾越的鸿沟。2.缩短了进化时间。3.使人能对生物体进行定向构造。第一节常用的工具酶工具酶(Toolenzymes)：DNA重组技术，需要利用一些酶在体外对DNA进行切割、连接等基因操作，这些酶常被称为工具酶。主要工具酶限制性核酸内切酶DNA连接酶逆转录酶DNA聚合酶Ⅰ碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶。一、限制性内切酶(restrictionendonuclease,RE)1.简称限制酶，是DNA重组技术的基本工具2.能识别和切割双链DNA分子特异序列的核酸水解酶3.在细菌体内与相伴存在的修饰酶（甲基化酶）共同构成细菌的限制－修饰体系，起限制外来DNA、保护自身DNA的作用二.命名※第一个字母（大写、斜体）该酶的微生物属名※第二、三个字母（小写、斜体）代表微生物种名※第四个字母（斜体）代表寄主菌的株或型※用罗马数码I、II、III等区分同一株具有不同特异性的酶例流感嗜血杆菌中三个酶的命名：Haemophilusinfluenzaed属名种名株系HindIIIIIIHindIHindIIHindIII三.分类根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为：I型II型III型1.I型限制酶属于复合功能酶，兼有修饰和切割DNA两种特性。功能核酸内切酶甲基化酶ATP酶DNA解旋酶特点：识别和切割位点不一致没有固定的切割位点随机切割不产生特异片段2.III型酶与I型酶特性类似，也有甲基化功能，但无ATP酶和DNA解旋酶活力。在DNA链上有特异位点切割，其切割位点在识别位点以外。3.II型酶（1）II型酶的识别识别序列一般为4-6个碱基对，通常是反转重复顺序，具有180º的旋转对称性。（2）II型酶的切割功能★平末端（bluntend)在识别顺序的对称轴上，对双链DNA同时切割。★5’端粘性末端（cohesiveend)在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的5’末端切割。★3’端粘性末端在识别顺序的双侧末端切割DNA双链，于对称轴的3’末端切割。4.少数有特殊性质的II型酶1异源同工酶（isoschizomer）定义：来源不同但能识别和切割同一位点的酶。5’CCGG3’3’GGCC5’5’CCGG3’3’GGCC5’HpaII、MspI2同尾酶（isocaudarner)为识别与切割顺序相互有关的酶。有些限制酶的识别序列包含在另一些限制酶的识别顺序之中酶来源不同，但它们作用后能产生相同的粘性末端。5’GGATCC3’3’CCTAGG5’5’AGATCC3’3’CCTAGA5’BamHIBagII5’GGATCC3’3’CCTAGG5’特点：两个同尾酶消化的DNA片段，可以相互连接，连接后的重组DNA分子，可以被其中一种酶识别，也可能原来的任何一个同尾酶均不能识别。（1）酶活力单位限制性内切酶活力单位规定如下：在合适温度、pH值和离子强度等条件下，1小时内完全消化1μg特异DNA底物所需的酶量，定义为一个活力单位。5.限制性内切酶活力单位和星号活力（2）星号活性•限制性内切酶在非标准反应条件下，对识别序列的特异性下降，能切割一些与特异识别顺序类似的序列，一般在酶的右上角加*表示。•如克隆过程中需同时进行双酶切，应选用二种酶都能接受的反应缓冲体系（可查阅试剂供应商手册获得），否则可能出现星号活性。（3）特点：星号活力的识别形式常对标准识别顺序中两侧的碱基没有特异性。GACTAGCNAATTNTACGCAATTTCTGATCGNTTAANATGCGTTAAAEcoRI*EcoRI*（4）产生的原因a.高甘油含量（5%V/V)b.内切酶用量过大，一般为100U/gDNAc.低离子强度25mmol/Ld.高pH值pH8.0e.含有机溶剂：DMSO、乙醇、乙烯二乙醇Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的离子存在（5）常见容量发生星号活力的酶有：EcoRI、HindIII、KpnI、PstI、ScaI、SalI、XmnI、HinfI、BssHII、EcoRV（6）其他注意事项：•底物DNA不能含有痕量的酚、氯仿和乙醚•溶液不能含大于10mmol/L的EDTA、SDS和过量的盐•反应缓冲体系中一般加入2-巯基乙醇或二硫苏糖醇防止含巯基酶的氧化失活•加入牛血清白蛋白稳定酶活性•操作时应注意混匀反应体系，这也是常见的酶切失败原因之一6.甲基化酶许多细菌有限制－修饰系统限制（降解）外来DNA，并通过对自身DNA的修饰而起保护作用Ⅱ类限制－修饰系统•由两种酶分子组成的二元系统•一种为限制性内切酶，另一种为独立的甲基化酶•这两种酶识别序列相同•如PstⅠ甲基化酶使A甲基化形成5′-CTGCmAG-3′大肠杆菌株一般有dam甲基化酶和dcm甲基化酶甲基化酶的应用甲基化酶亦是分子克隆的重要工具酶当制备克隆用双链cDNA时，外源DNA片段可用M.EcoRⅠ甲基化酶处理，使双链cDNA内部EcoRⅠ位点则因甲基化受到保护而不被切割7.II型限制酶的用途（1）DNA重组克隆及亚克隆（2）DNA杂交与序列分析（3）改建质粒（4）构建基因组DNA物理图谱和文库等二、DNA聚合酶(DNApolymerase)1、大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段（Klenow片段）（1）大肠杆菌DNA聚合酶I特性：具有3种酶活性5’3’外切功能3’5’外切功能聚合酶功能5’CCG3’GGCTATCGA5’聚合酶dATPdTTPdGTPdCTP5’CCGATAGCT3’3’GGCTATCGA5’a.5’3’DNA聚合酶活性底物：单链DNA模板及带3’羟基的DNA引物5’CCG3’3’GGC5’聚合酶5’CCGATAGCT3’3’GGC5’ATAGCTb.3’5’外切酶活性底物：带3’羟基的双链DNA或单链DNA、从3’羟基端降解DNA。对双链DNA链的外切核酸酶活性可被5’3’DNA聚合酶活性所封闭。c.5’3’外切酶活性：能从游离的5’末端降解DNA成为单核苷酸。5’CCGATAGCT3’3’GGCTATCGAAT5’聚合酶5’CCGATAGCT3’3’GGCTATCGA5’TATA（2）Klenow片段从大肠杆菌DNA聚合酶I中去除5’3’外切酶活性，即得Klenow片段。其只具有5’3’聚合酶活性3’5’外切酶活性35kD76kD苦草杆菌蛋白酶裂解全酶5’3’外切酶5’3’聚合酶3’5’外切酶5’3’聚合酶3’5’外切酶Klenow片段DNA聚合酶I全酶应用1.催化DNA切口平移反应，置备高比活DNA探针。(大肠杆菌DNA聚合酶I）DNaseIDNA聚合酶IdNTP32P-dNTP2.对DNA分子进行末端标记（Klenow）2.TaqDNA聚合酶(1)特性：①耐热的DNA聚合酶来自于嗜热的栖热水生菌Thermusaquaticus中纯化而来的。②5’3’聚合酶活性③5’3’外切酶活性④最佳作用温度为75-80C（2）用途①通过PCR对DNA分子的特定序列进行体外扩增②对DNA进行测序3.反转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶，RDDP）reversetranscriptase（1）特性①催化从RNA为模板的DNA聚合反应②具3’5’RNA外切酶活性，能特异性降解RNA—DNA杂交分子中的RNA部分③具DNA指导的DNA聚合酶（DDDP）的功能④能以mRNA为模板催化合成出互补的DNA（cDNA）（2）分类①禽源反转录酶来自禽或骨髓细胞瘤病毒（AMV）具有聚合酶活性及强的RNA酶H活性无3’5’外切酶活性。温度42CpH8.6时活性较高②鼠源反转录酶来自Moloney鼠白血病病毒（M-MLV）具有聚合酶活性及相对较弱的RNA酶H活性无3’5’外切酶活性温度37CpH7.6时活性较高4.末端脱氧核糖核酸转移酶（末端转移酶）催化dNTP加到DNA分子的3’羟基端3’末端标记添加多聚体尾三、DNA连接酶1.定义：DNALigasesareprimarilyresponsibleforjoiningthegapsthatforminDNAduringreplication(i.e.,thejoiningofOkazakifragmentsformedbydiscontinuousorlaggingstrandreplication),DNArepair,andrecombination.催化双链DNA一端的3’OH与另一双链DNA5’的磷酸根形成3’，5’-磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平末端的DNA末端连接起来。三、DNA连接酶注意：DNA连接酶只能作用于双链DNA分子而不能将二个单链DNA分子连接。DNA连接酶是重要的基因重组的工具酶应用DNA连接酶将具有相同粘性末端或平端的DNA分子连接起来。DNA连接酶的特点：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶T4噬菌体DNA连接酶能连接带粘性末端或平末端的DNA分子大肠杆菌DNA连接酶不能连接平末端DNA分子DNA重组技术常用T4噬菌体DNA连接酶T4噬菌体DNA连接酶连接带粘性末端DNA分子的效率远高于连接平末端的DNA分子连接反应需要ATP、Mg2+和二硫苏糖醇，最适pH为7.2~7.4，ATP为连接反应提供能量，二硫苏糖醇可提高连接效率3.特点：催化DNA5’磷酸基与3’羟基之间（切口）形成磷酸二酯键。切口(nick)：DNA分子糖-磷酸主键的破坏。缺口(gap)：DNA分子中核苷酸缺失。2.分类：T4噬菌体DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶4.用途：①连接带匹配粘端的DNA分子。②使平端的双链DNA分子互相连接或与合成接头相连接。5.反应例解：（1）互补粘端DNA(或切口间的连接)5’ACGOHpAATTCGT3’3’TGCTTAApHOGCA5’ATP、Mg2+T4连接酶5’ACGAATTCGT3’3’TGCTTAAGCA5’（2）平端连接5’CGAOGpCGTA3’3’GCTpOHGCAT5’ATP、Mg2+T4连接酶5’CGACGTA3’3’GCTGCAT5’四、T4多核苷酸激酶T4polynucleotidekinase(T4PNK)催化将ATP的-磷酸转移到DNA链的5’末端1.反应分类（1）前向反应将ATP的-磷酸转移到脱磷酸的DNA链的5’末端（2）交换反应过量的ADP使T4多核苷酸激酶将5’-末端磷酸从磷酸化的DNA链中转移到ADP上生成ATP，然后再从[-32P]dATP上将标记的磷酸转移到DNA链上，使其重新磷酸化。用途①标记DNA链的5’末端②连接反应五、碱性磷酸酶alkalinephosphat