基因重组与基因工程-中国医科大学

基因重组与基因工程GeneticRecombinationandGeneticEngineering第十四章ThebiochemistryandmolecularbiologydepartmentofCMU第一节DNA的重组DNARecombinationDNA重组接合作用(conjugation)转化作用(transformation)转导作用(transduction)转座(transposition)同源重组(homologousrecombination)位点特异的重组(site-specificrecombination)发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。一、同源重组Holliday模型中，同源重组的4个关键步骤①两个同源染色体DNA排列整齐②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体③通过分支移动产生异源双链DNA④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)片段重组体切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。内切酶(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移(recA)内切酶(recBCD)DNA连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´5´3´3´3´DNA连接酶片段重组体5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)5´3´5´5´5´3´3´3´拼接重组体5´5´5´5´3´3´3´3´5´3´5´5´5´3´3´3´DNA连接酶二、细菌的基因转移与重组（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。可接合质粒如F因子(Ffactor)（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用(transformation)。例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。λ噬菌体的生活史溶菌生长途径(lysispathway)溶源菌生长途径(lysogenicpathway)转导过程三、位点特异重组位点特异重组(site-specificrecom-bination)是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。（一）λ噬菌体DNA的整合λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(longterminalrepeat,LTR)。P1H1P2hinH2阻遏基因DNAHin重组酶P1H1P2hinH2阻遏基因沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变。H片段H1鞭毛蛋白H2鞭毛蛋白阻遏蛋白P2P2hixhix（二）细菌的特异位点重组（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(和)，一个编码重链。轻链的基因片段：重链的基因片段：LVJCLVDJC重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重组酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCACTGTTTTTGG重组信号序列基因片段V片段J片段RSSRSS间插DNAOHOHVJ单链切开RAG1RAG2分子内转酯反应单链切开转移核苷酸修复、连接免疫球蛋白基因重排过程四、转座重组由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。插入序列(insertionsequences,IS)组成：二个反向重复序列(invertedrepeats,IR)侧翼的正向重复序列一个转座酶（transposase)编码基因IRTransposaseGeneIR转座形式：保守性转座(conservativetransposition)复制性转座(duplicativetransposition)（一）插入序列转座插入序列的复制性转座转座子(transposons)——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。转座子组成：反向重复序列转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposaseGene抗性基因（二）转座子转座由转座子介导的转座第二节重组DNA技术DNARecombinationTechnique重组DNA技术的发展史1865年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉一、相关概念–DNA克隆–工具酶–目的基因–基因载体二、基本原理及操作步骤本节主要内容一、重组DNA技术相关概念克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一）DNA克隆DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等。目的①分离获得某一目的基因或DNA②获得目的基因的表达产物（蛋白质）基因工程(geneticengineering)——实现基因克隆所用的方法及相关的工作，又称重组DNA技术。（二）工具酶•限制性核酸内切酶•DNA聚合酶Ⅰ•逆转录酶•T4DNA连接酶•碱性磷酸酶•末端转移酶•TaqDNA聚合酶重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ①合成双链cDNA分子或片段连接②缺口平移制作高比活探针③DNA序列分析④填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶①合成cDNA②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。分类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类（基因工程技术中常用的是Ⅱ类）第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名：HindⅢ属系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶Ⅱ类酶识别序列特点：——回文结构(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAGGATCTA（三）目的基因•cDNA(complementaryDNA)•基因组DNA(genomicDNA)（四）基因载体定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。载体的选择标准•能自主复制；•具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；•有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；•分子量小，以容纳较大的外源DNA。1.质粒(plasmid)特点:能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。λ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）2.噬菌体(phage)M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列MultipleCloningSites3.柯斯质粒(cosmid)pJB8的物理图谱酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)动物病毒DNA改造的载体腺病毒载体逆转录病毒载体杆状病毒载体其他二、重组DNA技术基本原理目的基因的获取重组DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达以质粒为载体的DNA克隆过程（一）目的基因的获取1.化学合成法已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)1.化学合成法由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列组织或细胞染色体DNA基因片段克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌存在于转化细菌内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合2.基因组DNA文库限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制3.cDNA文库逆转录酶AAAATTTTAAAASI核酸酶DNA聚合酶Ⅰ碱水解TTTT是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术，又称为无细胞的分子克隆。4.聚合