基因重组与基因工程1030和112

第十四章基因重组与基因工程姚真真生物化学与分子生物学教研室Generecombination&Geneengineering中心法则逆转录转录RNA翻译蛋白质复制DNA生物体环境基因的表达调控适应环境了解中心法则对天然的DNA进行改造为人类服务基因工程即DNA重组技术。在分子水平上进行遗传操作，按设计的蓝图，从供体中提取或人工合成目的基因，使其与载体构建成重组DNA，再转移到受体细胞。目的基因在受体细胞中表达，获得新的遗传性状。基因工程苏云金芽胞杆菌（BT）毒素蛋白基因荧光蛋白酶基因转胃安素番茄高锌西洋番茄转虾青素胡萝卜痢疾疫苗土豆乳汁中分泌人凝血因子的转基因山羊乳汁中分泌人蛋白因子的转基因猪主要内容DNA重组重组DNA技术重组DNA与医学的关系不同DNA之间发生共价连接形成新的DNA分子。基因移动和重组是生物界普遍现象，是生物进化的动力，DNA重组具有重要的生物学意义DNA重组概念第一节DNA重组DNA重组的类型位点特异性重组（site-specificrecombination）接合(conjugation)转化(tranformation)转导(transduction)同源重组（homologousrecombination）转座重组（transpositionrecombination）细菌的基因转移与重组一、细菌的基因转移与重组接合(conjugation)转化(tranformation)转导(transduction)（一）接合作用(conjugation)指通过细胞的直接接触(如菌毛)，遗传信息从供体细胞单向转移到受体细胞的过程。接合转移F因子染色体DNA性鞭毛Griffith肺炎球菌转化实验（二）转化（transformation）相关概念：转化：细胞从周围介质中吸收裸露的DNA,而获得新的遗传表型。感受态细胞（competentcell）:具有摄取周围介质中游离DNA分子能力的细菌细胞。转化过程：DNA片断细菌摄取DNA片断重组细菌性状改变（三）转导（transduction）通过病毒（噬菌体）介导发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移和重组过程。溶菌感染重组感染细菌噬菌体转导溶菌途径溶原途径噬菌体感染宿主后的两种结局cI基因cro基因溶原状态cI基因cro基因溶菌状态噬菌体感染宿主菌后的两种状态是由噬菌体的cI和cro两个基因编码调控蛋白控制的，溶原状态，cI表达；溶菌状态，cro表达。除了控制其他基因表达外，cI和cro两个基因编码调控蛋白是互为阻遏蛋白。结合协同cI基因cro基因溶原状态cI基因cro基因溶菌状态思考：当含噬菌体的细菌用紫外线轻度照射后，cI蛋白被降解,接下去会发生什么？停止照射后会怎样？为什么会进化成这种机制？结合协同二、同源重组（homologousrecombination）不需要特异DNA序列，而是依赖两分子之间序列的相同或相似性而进行的重组。同源序列愈长，同源重组率愈高，反之，则不易发生重组。概念同源重组意义同源重组发生在任何生物中。细菌如果通过接合或转化获得的外源DNA与宿主DNA充分同源，那末外源DNA就可以整合进宿主的染色体。同源重组也是DNA损伤修复的重要机制ElectronmicrographofaHollidayJunctionHollidayJunction(A)ThestructureofaHollidayjunctionboundbyCrerecombinase(gray),abacteriophageprotein.(B)AschematicviewofaHollidayjunction.5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´分支迁移(recA)5´3´5´3´5´3´5´3´内切酶(recBCD)5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´5´内切酶(recBCD)5´3´3´3´DNA侵扰(recA)3´5´5´3´5´3´5´3´DNA连接酶Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´E.coli的同源重组过程：5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´3´5´5´5´5´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)5´5´5´5´3´3´3´3´5´3´5´5´5´3´3´3´DNA连接酶3´5´5´5´5´3´3´3´拼接重组体DNA连接酶5´5´5´5´3´3´3´3´片段重组体Holliday模型同源重组步骤①两个同源染色体DNA排列整齐②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体③通过分支移动产生异源双链DNA④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)片段重组体（见模型图右边产物）：切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。5´5´5´5´3´3´3´3´片段重组体拼接重组体（见模型图左边产物）：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。3´5´5´5´5´3´3´3´拼接重组体位点特异性重组：由整合酶催化，在两个DNA位点特异的短序列之间发生的切割和连接反应:噬菌体DNA整合细菌特异位点重组免疫球蛋白基因的重排三、位点特异性重组（一）λ噬菌体DNA的整合λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(longterminalrepeat,LTR)。attPattBE.coliDNAInt,IHFInt,IHF,XisDNA噬菌体DNA的整合和切除att:attachmentsite,Int:integrase,IHF:integrationhostfactor,Xis:excisionasePOP´BOB´BOP´POB´attLattR整合切除hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。（二）细菌的特异位点重组沙门氏菌H片段特异位点重组(倒位)决定鞭毛相转变DNAH片段h1H2与阻遏基因mRNAHin重组酶H2鞭毛素阻遏蛋白(a)hinh2阻遏基因rh1启动序列hinmRNAPPhixhixhinh2阻遏基因rh1H片段倒位h1hinmRNAH1mRNAHin重组酶H1鞭毛素(b)PP沙门氏菌H片段特异位点重组(倒位)决定鞭毛相转变（二）细菌的特异位点重组（三）、免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(和)，一个编码重链。轻链的基因片段：重链的基因片段：LVJCLVDJCTheorganizationofmouseimmunoglobulingenesegments.Theorganizationingermlinecellsisshownontheleft,andtherearrangedorganizationcharacteristicofmatureBlymphocytesisshowntotherightofthearrows.Therearrangedstatesshownarebutsingleexamplesofthemanypossibilitiesforeachgenefamily.Consensuselementsarelocatedaboveandbelowgermlinevariable-regiongenesthatrecombinetoformgenesencodingimmuno-globulinchains.Theseconsensuselementsarecomplementaryandarearrangedinaheptamer-nonamer,12-bpto23-bpspacerpattern.-Chain-ChainH-Chain231223122312CACAGTGACAAAAACCACAAAAAACCCACAGTG此重排的重组酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。RAG1识别九核苷酸序列，RAG2加入复合物，切割七核苷酸序列位点等CACAGTGACAAAAACCGTGTCACTGTTTTTGG7核苷酸序列12/23间隔序列9核苷酸序列重组信号序列（RSS）重排机制：重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombinationsignalsequence,RSS)。V片段J片段RSSRSS间插DNAOHHOVJ单链切开RAG1RAG2分子内转酯反应单链切开转移核苷酸修复、连接免疫球蛋白基因重排过程-OH亲核攻击四转座重组（transposition）由插入序列和转座子介导的基因转移或重排。许多数细菌基因组含有几十个拷贝的能转座DNA片段，片段长度从几百到几万个bp,是遗传多样性的一个重要来源。转座重组分类：插入序列(insertionsequence，IS)转座:由转座酶（transposase）、一个分离的反向重复序（invertedrepests）列和侧翼二个正向重复序列（directrepeats）组成。发生形式：保守性转座(conservativetransposition)复制性转座(duplicativetransposition)转座子（transposon，Tn）转座：除了有插入序列的结构外，还带有抗性或其他标记基因。转座序列结构反向重复序列反向重复序列转座酶基因IS转座酶基因ampR反向重复序列Tn3转座酶基因tetRTn10IS细菌中的三种转座子类型插入序列的复制性转座转座子(transposons)——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。转座子组成：反向重复序列转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposaseGene有用基因转座子转座由转座子介导的转座Exonshufflingbytransposition.(a)TranspositionofanexonflankedbyhomologousDNAtransposonsintoanintrononasecondgene.transposasecanrecognizeandcleavetheDNAattheendsofthetransposoninvertedrepeats.Ingene1,ifthetransposasecleavesattheleftendofthetransposonontheleftandattherightendofthetransposonontheright,itcantransposealltheinterveningDNA,includingtheexonfromgene1,toanewsiteinanintronofgene2.Thenetresultisaninsertionoftheexonfromgene1intogene2.转座子转座---外显子重组（混编）外显子混编（Exonshuffling）：产生许多新功能的蛋白质外显子混编是生物进化的一个重要过程，得益于真核生物DNA编码序列的组织方式：断裂基因含有长长的内含子，含有许多的重复序列，并处于外显子的两侧。因此，内含子的存在提供了外显子混编的基础。有人提出人基因组编码的约6万种蛋白质是从几千个独立的外显子混编而来。第二节重组DNA技术重组DNA技术相关概念及意义重组DNA技术的原理及过程重