基因重组及遗传分析

第五章细菌基因重组及遗传分析基因重组（generecombination）是指不同来源的遗传物质通过转移和交换而重新组合的过程。高等动植物和许多产生有性孢子的真核微生物的基因重组都是通过有性世代来完成。在细菌中，提供部分遗传物质或少数基因的一方称为供体（donor），而获得基因的另一方称为受体（recipient）。第一节转化（Transformation）转化：是指某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型细胞的DNA而使受体的基因型和表型发生相应变化的现象。转化现象的发现和转化因子的证实对促进现代分子生物学的诞生和发展产生了巨大的推动作用。在实验室条件下，通常用CaCl2、cAMP、低温培养、PEG介导及电脉冲等方法转化细菌或其它微生物。细菌转化的过程大体可分为三个阶段：•感受态的出现•DNA的吸附和进入•DNA的整合1.感受态的出现感受态（competence）：是指受体菌细胞最容易接受外源DNA并使之不被DNA酶降解的生理状态。一、转化过程和机制细菌细胞在特定时期产生一种称为感受态因子的小分子蛋白（5-10kD）。这种感受态因子可与细胞表面受体蛋白结合，使细胞产生感受态特异蛋白，其中包括细胞壁自溶素。自溶素使细胞表面的DNA结合蛋白及核酸酶裸露出来，使其具有与DNA结合的活性。因此，当细菌表面出现许多DNA结合位点时，就意味着细菌出现了感受态。4.进入细胞的单链与寄主DNA同源区重组并整合到染色体上革兰氏阳性菌1.双链DNA片段在DNA结合蛋白（黑色点）的帮助下吸附到细胞表面并由核酸酶（紫色椭圆）切成缺口2.由核酸酶降解其中一条单链3.未被降解的单链与感受态特异蛋白相互作用并进入细胞2.DNA的吸附和进入在流感嗜血菌中，其感受态细胞形成一种结合双链DNA的膜结构，称为转化小体（transformasome）。该小体吸附DNA后，与细胞的内外膜相融合而转入细胞内侧，再将双链变成单链DNA。转化小体双链DNA被转化小体摄取转化的双链DNA（30-50kb）结合到膜受体上很快进行同源重组使外源DNA整合到染色体上革兰氏阴性菌DNA在进入感受态细胞之前，要经过可逆性吸附和不可逆性吸附。可逆吸附的DNA对DNA酶敏感，并可以洗脱下来。随着感受态细胞膜蛋白的参与，可逆性吸附逐步向不可逆吸附转化，不可逆吸附DNA对DNA酶不敏感。吸附到细胞表面是双链DNA，而不是单链DNA实验证明：肺炎链球菌的转化因子在100℃下逐渐失去转化活性(DNA发生变性)。在逐渐冷却过程中活性逐渐恢复(单链DNA复性成双链)。说明完整的DNA双链结构对于转化活性来说是必要的，转化的第一步，需要双链DNA才能结合到细胞表面的结合位点上。当DNA吸附后，被酶解开成单链DNA，只有单链DNA才能进入细胞内并与受体染色体DNA进行整合。流感嗜血菌特异性摄取序列：5’AAGTGCGGTCA3’淋病奈瑟球菌特异性摄取序列：5’GCCGTCTCAA3’在流感嗜血菌的染色体上有600个拷贝的摄取序列。摄取序列虽然只有10-12bp，但很少随机地出现在其他物种的DNA序列中，因此这些细菌对外源DNA的吸收具有选择性。为什么有些细菌对摄取的DNA有特异性要求呢？近年来的研究表明，G-菌和G＋菌对单链DNA也能进行有效转化，但一般是在较低的pH值下进行的。外源DNA片段在受体细胞中的命运：外源DNA（红色）转化到受体细胞后，通过同源重组整合到染色体上，否则被降解成核苷酸。3.DNA的整合转化为相同或相近物种之间的同源重组提供了可能性，是自然界中基因交换的一条重要途径，在生物变异和进化中起着重要作用。转化的效率决定于下列三个内在因素：①受体细胞的感受态，决定转化DNA能否进入细胞②受体细胞的限制系统，决定转化DNA在整合前是否被分解③供体和受体DNA的同源性，决定转化DNA的整合。由于转化DNA总是与顺序相同或相似的受体DNA配合，所以亲缘关系越近的其同源性也越强，转化效率也越高。二、人工转化1.通过二价阳离子处理，大肠杆菌等部分G-细菌能产生感受态2.通过制备原生质，大多数细菌特别是某些G+细菌已知许多细菌包括大肠杆菌均无自然转化的能力，但经人工诱导可使它们形成感受态。如：1970年Mandel和Higa首先发现DNA在含有高浓度Ca2+的条件下能够被受体细胞摄入和转化，随后的实验证明由Ca2+诱导的人工转化的大肠杆菌中，其转化DNA必须是一种独立DNA复制子。1.大肠杆菌的转化随着研究技术的改进和经验的积累，人们已经建立了用Ca2+、Mg2+等诱导转化的标准程序，能对大肠杆菌菌株C600、JMl01、JMl09、DH5a等进行有效的转化。先将大肠杆菌培养至OD600=0.5～1接着用50-100mmol／LCaCl2处理制备成感受态细胞然后将DNA与感受态细胞混合在冰浴中反应20-40min进行42℃热击可增加DNA的吸收（107个转化子/ug质粒DNA）最经典的转化方法是：由于异源的质粒DNA分子能够进入大肠杆菌细胞，所以大肠杆菌摄取DNA是非选择性的。2.PEG介导的转化不能自然形成感受态的G+细菌如枯草芽孢杆菌和放线菌，可通过聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG，一般用PEG6000)的作用实现转化。这类细菌必须首先用细胞壁降解酶完全除去它们的肽聚糖层，然后使其维持在等渗的培养基中，在PEG存在下，质粒或噬菌体DNA可被高效地导入原生质体。3.电脉冲法（电穿孔法）在许多细菌和真核系统中，它们既无自然的感受态呈现也不能用上述的方法建立感受态。因此人们发展了一种新的将核酸分子导入细胞的方法，最突出的是电穿孔(electroporation)法和基因枪(biolistic)转化法。电穿孔法：是用高压脉冲电流击破细胞膜或将细胞膜击成小孔，使各种大分子(包括DNA)能通过这些小孔进入细胞，所以又称电转化。电场强度、电脉冲的长度和DNA浓度4.基因枪(biolistic)转化基因枪转化法首先由Sanford报道，该方法是将包裹有DNA的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使DNA留在细胞内，特别是留在细胞器中。用这种方法首次成功地将DNA导入酵母线粒体并引起线粒体遗传变化。基因枪转化现在被广泛地应用于植物的转化中三、建立转化方法的策略1.被转化对象（转化受体）2.转化DNA的构建（目的）3.转化方法选择四、转化应用在转化中，如果转化因子的两个基因是连锁的，那么它们可以同时被转化，也称为共转化，连锁的两个基因距离越近，其共转化频率越高，反之则低。利用共转化率和连锁的二基因间的距离的反比关系可进行基因定位的工作。1.连锁检测2.遗传图谱的绘制基因型数目trp2his2tyr1+++11940−++3360−−+685−+−418+−−2600+−+107++−1180trp2+his2+tyr1+（供体）×trp2-his2-tyr1-（受体）的转化类型trp2-his2重组率=2600+107+3660+418×100%=34%11940+1180+2600+107+3660+418trp2-tyr1重组率=2600+1180+3660+685×100%=40%11940+107+2600+1180+3660+685his2-tyr1重组率=418+1180+685+107×100%=13%11940+3660+418+1180+685+107trp2his2tyr13413403.基因中断4.插入基因第二节接合作用（conjugation）接合作用：是指在供体细胞和受体细胞直接接触后，质粒从供体细胞向受体细胞转移的过程，也称细菌杂交。一、接合现象的发现与证实Lederberg和Tatum（1946年）建立了用大肠杆菌K12的两个营养缺陷型菌株在基本培养基上是否生长，来检验细菌杂交或重组存在的方法。在此以前，没有人证实细菌杂交现象。细菌杂交有别于典型的有性杂交，故称为细菌接合作用。A菌株B菌株混合培养后在基本培养基中出现的原养型菌落是否是杂交的结果？必须要排除下列几种解释：一是细菌细胞并没有接合，而是交换了DNA(转化作用)二是细胞并未接合，而是通过培养基交换了养料(互养)三是细菌细胞并未接合而是亲本发生了回复突变当时Lederberg和Tatum已经证明，当把A菌株的培养液经过灭菌，再加入到B菌株的培养液中，没有原养型菌落，这说明上述实验并非转化的结果。1950年，Davis通过他的U形管试验进一步支持了Lederberg和Tatum的结论。1.转化作用的排除营养缺陷型细胞通过培养基交换养料而生长的现象亦称为互养。2.互养的排除在A-B+T1s和A+B-T1r的杂交中，将基因型A-B+T1s和A+B-T1r两种细菌在基本培养基上混合培养，接触较短的一段时间以后，喷上噬菌体T1，把A-B+T1s细菌杀死。经培养以后仍有原养型菌落出现，这说明原养型菌落的出现并非由于互养。因为大肠杆菌的突变率一般都10-8，若两个基因同时回复突变，则其可能性只有10-16（10-8×10-8），这种几率在平板上是很难检测到的，所以混合培养能出现10-5~10-6频率的菌落一定是重组的结果。3.回复突变的排除4.遗传物质的单向转移正交实验（A）Strs×（B）Strr用链霉素将A菌株杀死重组体的数目变化不大(A)Strr×(B)Strs将B菌株杀死一个重组体也没有出现反交实验（A）met-bio-（Strr或Strs）×（B）thr-leu-thi-（Strs或Strr）Hayse（1952）用正反杂交实验证明，细菌重组的发生只是染色体单方向的转移，而且染色体的转移往往不完全。把A菌株认为是供体，而B菌株是受体A菌株作为遗传物质的供体，当链霉素对它进行灭活以后，并未影响它传递遗传物质的能力。B菌株作为遗传物质的受体，一旦被链霉素杀死以后，必然不能出现重组体。供体菌株又称为雄性细胞，受体菌株又称为雌性细胞StrrA突变型（不育变种）⊙置冰箱1年后供体的A菌株Strr×B菌株Strs可育的StrsA菌株共培养，一起繁殖不能得到杂交子StrrA菌株×B菌株Strs恢复了StrrA突变型的可育性5.F质粒的发现(Hayes)①大肠杆菌的供体或雄性细胞(如A菌株)记为F+，带有一个性因子或致育因子F(fertilityfactor)，而另一个不带性因子F的受体或雌性细胞(如B菌株)叫做F-；②杂交F+×F-是可育的，杂交F-×F-是不育的；③F因子可以传递，从F+到F-细菌，但必须通过细胞接触④F因子能够自发丧失，一旦丧失就不能再恢复，除非从另一个F+细胞再把它传递过来。分析结果：F因子是染色体外的一种遗传结构，也就是质粒(plasmid)。F+是一种遗传性状F因子的存在使细菌成为F+F因子的丧失使细菌成为F-F+细菌分裂仍得到F+细胞二、F质粒的结构及其在细胞中的存在状态1.F质粒的遗传结构F质粒的基因组由三个主要区段组成：转移区、复制区、插入区。长度为33kb，由23个基因组成，构成一个tra操纵子(traoperon)。traABCEFGHKLQUVW与性菌毛的形成有关traYZMIGD等与F因子的转移有关traG、traN影响杂交对的配对形成与否traI、traM决定DNA转移起始traI编码解旋酶I(helicaseⅠ)traD控制DNA转移；traY、traZ编码的核酸内切酶能在转移起始区oriT上切开一个缺口。（1）转移区(transferregion)复制区负责F质粒的自我复制F质粒自主复制区为oriV（Vegetativeoriginofreplication），在oriV中包含有复制起点。F质粒的复制是按θ型方式进行复制，它是一种严紧型质粒。F质粒的拷贝数能被精确地控制，一个寄主细胞约有1~2个F质粒。rep（Freplicativeprotein）编码一组与F质粒复制相关的蛋白质。inc（incompatibility）基因产物使细胞具有不相容性。（2）复制区（replicationregion）F质粒插入区包含4个插入顺序：2个IS31个IS21个Tn