基因重组工程

第十七章基因重组与基因工程(geneticrecombinationandgeneticengineering)基因重组是指在体外用酶学方法将不同来源的DNA进行切割、连接，组成一个新的DNA分子的过程，又称DNA重组。基因克隆将重组DNA分子导入到合适的受体细胞中，使其扩增和繁殖，以获得大量的同一DNA分子，称此为基因克隆、DNA克隆或分子克隆。基因工程实现基因克隆所采用的方法和相关工作，统称为重组DNA技术或基因工程。重要的工具酶基因克隆常用的载体重组DNA基本原理重组技术在医学和制药工业中的应用第一节重要的工具酶工具酶基因工程中的工具酶主要是指用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、修饰、反转录等有关的各种酶系统。一、限制性核酸内切酶(RE)是一类由细菌产生的能专一识别双链DNA中的特定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键的核酸内切酶，简称限制酶或切割酶。根据限制酶的作用特性，一般分为三类：——Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，其中常用的是Ⅱ型限制酶。限制酶（Ⅱ型）识别及切割位点特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的DNA片断，主要产生3种缺口：5ˊ－粘性末端3ˊ－粘性末端平端或钝端回文序列是指该部位的核苷酸序列呈180O旋转对称;粘性末端是指经内切酶特异切割后产生的5ˊ－末端突出或3ˊ－末端突出的碱基序列相互具有互补性。⑴产生5'-粘性末端⑵产生3'-粘性末端-CTGCA-G5'3'G-ACGTC-3'5'-CTGCA-G5'3'G-ACGTC-+PstI3'5'⑶产生平(头末)端/钝端5'-CCC3'-GGGGGG-3'CCC-5'+SmaI5'-CCC3'-GGGGGG-3'CCC-5'其它特殊性质的Ⅱ型限制酶同裂酶（异源同工酶）同尾酶可变酶同裂酶又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的识别序列。在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平头末端，称为同识同切；切割点也可以是不同的，产生3ˊ或5ˊ粘性末端，称为同识异切。同裂酶——同识同切5'-TTT3'-AAAAAA-3'TTT-5'+AhaⅢDraⅠ5'-TTT3'-AAAAAA-3'TTT-5'同裂酶——同识异切GCCATGGTACCGGGTACCCCATGGGGTACCCCATGG+KpnI5'-G3'-CCATGGTACC-3'G-5'+Asp718I5'-3'--3'-5'5'-3'--3'-5'5'-3'--3'-5'同尾酶GCCTAGGATCCGGATCCTAGGATCCTAG5'-3'--3'-5'MboⅠBamHⅠBglⅡ5'-3'--3'-5'5'-A3'-TT-3'A-5'同尾酶指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后产生相同的粘性末端。可变酶可变酶识别顺序中的一个或几个碱基是可变的，并且识别顺序往往超过6个碱基对。如，BstpⅠ，其识别顺序为GGTNACC。常用限制性核酸内切酶的特性微生物名称酶名称识别顺序同裂酶同尾酶BacillusamyloliquefaciensH解淀粉芽孢杆菌BamHⅠGGATCCBstⅠBglⅡMboⅠBacilliusglobigil球芽孢杆菌BglⅡACATCTEscherichiacoliRY13大肠杆菌EcoRⅠGAATTCHaemophilusinfluenzae流感嗜血菌HindⅢAAGCTTHsuⅠProvidenciastuartii164普罗威登细菌PstⅠCTGCAGSalpⅠStreptomycesalbusSubspeciespathocidicus白色链球菌SalⅠGTCGACAvaⅠXhoⅠ二、DNA聚合酶（最常用的DNA聚合酶有以下4种）DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅰ大片段——Klenow片段TaqDNA聚合酶T4噬菌体DNA聚合酶㈠DNA聚合酶ⅠE.ColiDNA聚合酶Ⅰ（DNApolⅠ）是一个具有3种酶活性的多功能性酶。包括：5ˊ→3ˊDNA聚合酶活性5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性DNApolⅠ应用⑴催化DNA缺口平移反应，制备高比活性DNA探针；⑵第二条cDNA链的合成；⑶对DNA3’突出末端进行标记；⑷DNA序列分析。E.coliDNApol.Ⅰ催化切口平移㈡Klenow片段（DNApol.大片断）Klenow片段用途⑴补齐双链DNA的3ˊ末端；⑵用标记碱基补齐3ˊ末端；聚合酶KlenowDNA[-32P]dNTPα双链DNA粘端5'-外切酶Ⅲ变性+5'3'3'5'3'5'3'5'3'3'5'5'5'5'3'3'标记探针标记末端⑶在cDNA克隆中，用于第二股链的合成；⑷DNA序列分析。㈢TaqDNApol（耐热DNA聚合酶）作用特点1）TaqDNApol催化DNA合成的最适温度范围7075℃，2）95℃以上高温，半小时不失活，3）最适合用于聚合酶链反应（PCR）。第一课件网在线网站三、逆转录酶特点逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶活性：⑴以单链RNA为模板，催化合成cDNA单链⑵具有RNaseH活性，能水解RNA:DNA杂交链中的RNA⑶以DNA为模板，催化合成cDNA双链。逆转录酶的应用：⑴将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库；⑵补平和标记5ˊ-末端突出的DNA片段；⑶代替Klenow酶用于DNA序列分析；⑷制备杂交探针等。四、DNA连接酶(DNAligase)DNA连接酶可以催化带有粘性末端或平头末端的双链DNA中一条链的3ˊ－OH与另一条链的5ˊ－PO3H2形成磷酸二酯键而相连，从而构成一条完整的DNA长链。DNA连接酶的用途（1）两个双链DNA片段连接起来5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊT4DNA连接酶5ˊ-ACGAATTCGT-3ˊ3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ3ˊ-TGCTTAAGCA-5ˊ（2）修补带有缺口的双链DNA分子T4DNA连接酶五、碱性磷酸酶碱性磷酸酶(BAP)能够催化水解去除DNA或RNA5ˊ-端的磷酸基团。用途⒈制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子5ˊ－端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重组效率。⒉用32P标记5'-端前，去除5'-P，再通过激酶作用把放射性核苷酸加到5'-端进行标记。六、末端（脱氧核苷酸）转移酶(TdT)作用将标记或未标记的dNTP加到DNA的3ˊ—OH末端；也可催化载体分子或待克隆的DNA片断上加上互补的同聚尾，便于进一步连接。应用①探针标记P32-α.dGTPG32G32G32G32G32G32G32G32②在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接重要的工具酶工具酶活性限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNAT4DNA连接酶催化DNA5ˊ-磷酸与3ˊ-羟基形成磷酸二酯键DNA聚合酶以DNA为模板合成DNA逆转录酶以RNA为模板合成DNA碱性磷酸酶切除末端磷酸T4多聚核苷酸激酶催化核酸5'-羟基磷酸化末端脱氧核苷酸转移酶催化3'-端合成同聚体尾第二节基因克隆常用的载体载体(vector)是将外源DNA(目的DNA)片断引入宿主细胞的运载工具，其化学本质为DNA。本节主要内容载体必须具备的基本条件载体的种类常用的载体一、载体必须具备的基本条件⒈有自身的复制子，能独立复制⒉具备多个限制酶的识别位点(多克隆位点)⒊具有遗传表型或筛选标记⒋有足够的容量以容纳外源DNA片段。⒌表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、增强子等调控元件。⒍载体DNA中均有一段非必需区，将外源基因插入该非必需区，而载体本身不受影响。二、载体的种类*（一）克隆载体用来克隆和扩增DNA片段的载体，具有3点共性：⑴能够在受体细胞复制；⑵带有药物抗性基因，便于筛选；⑶可导入受体细胞。（二）表达载体除具有克隆载体所具有的性质外，还带有表达构件——转录和翻译所必须的DNA顺序。三、常用的载体（一）质粒(plasmid)：是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状DNA分子。作为克隆载体的质粒应具备以下特点：1.分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内，有较高的拷贝数2.具有1个以上的遗传标志，便于筛选3.具有多克隆位点总而言之，质粒载体应该是一种分子量较小、高拷贝的“松弛型”质粒，且具有一个以上遗传标志和多克隆位点的质粒。广泛应用的质粒：pBR32质粒、pUC系列等pBR322质粒①4363bp②含一个复制点③含一个抗氨卞青霉素标记(ampR)④一个抗四环素标记(tetR)⑤ampR和tetR基因内各有一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入当外原基因插入抗药基因位点时，AmpR→Amp敏感(AmpS)、TetR→Tet敏感(TetS).pUC系列质粒由pBR322和M13噬菌体构建而成的双链质粒载体；（1）2674bp；（2）有ampr和与M13噬菌体相同的多克隆位点（MCS）（3）有一个来自大肠杆菌的LacZ操纵子的DNA片断,编码半乳糖苷酶(二)λ噬菌体组成特点：双链线状DNA分子，全长50kb，含65个基因，在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为COS位点。λ噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长溶菌性生长（lyticpathway）噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补成环，在宿主菌体内连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。溶源性生长(lysogenicpathway)噬菌体感染细菌后，可将自身DNA整合到细菌的染色体中去，与之一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解。λ噬菌体两种生长途径（示意图）第三节重组DNA基本原理（DNA重组基本程序包括下列过程）分—获取目的基因和载体接—目的基因与载体的连接转—重组DNA导入宿主细胞筛—重组DNA的筛选与鉴定1、获取TTTTAAAA质粒外源DNA分子TTAATTAAAATTEcoRIEcoRIAATTDNA重组基本过程2、重组TTTTAAAAligaseTTAATTAAAATT“退火”AATT3、转化转化到宿主细胞中(如E.coli)宿主细胞染色体DNA重组质粒重组质粒4、筛选筛选含有重组质粒的菌株宿主细胞染色体DNA重组质粒含有外源DNA的“工程菌”5、克隆含有外源DNA的“工程菌”繁殖/扩增://://://://://://blog.sina.com.cn/s/blog_130027d700102x0b0.html://blog.sina.com.cn/s/blog_13002e7ab0102x4vo.html://blog.sina.com.cn/s/blog_130027d700102x0hb.html://blog.sina.com.cn/s/blog_13002e7ab0102x51a.html://blog.sina.com.cn/s/blog_130027d700102x0jf.html://blog.sina.com.cn/s/blog_130027d700102x0jh.html://