基因重组蛛丝蛋白聚乙烯醇复合支架材料的制备

1基因重组蛛丝蛋白-聚乙烯醇复合支架材料的制备魏梅红涂桂云陈登龙李敏基金项目：国家自然科学基金（30570956）；福建省发改委项目（2006-781）作者单位：350007福州福建师范大学生命科学学院（魏梅红、涂桂云、李敏），化学与材料学院（陈登龙）通信作者：李敏，Email:[e-mail]【摘要】目的探讨致孔剂NaCl粒径和比例、变性剂和聚乙烯醇（PVA）等因素对基因重组蛛丝蛋白-PVA复合支架材料形态及性能的影响。方法基因重组蛛丝蛋白溶解于98%甲酸，采用冷冻干燥粒子滤沥法制备重组蛛丝蛋白-PVA复合多孔支架，采用扫描电子显微镜观察支架的形态，采用单纤维强力试验机测试支架机械性能。结果乙醇作变性剂制得的多孔支架力学性能较好，支架的断裂应力、断裂比强度均提高5倍，断裂伸长率可达12.21%。以粒径500μm的NaCl为致孔剂制得的多孔支架力学性能较好。高分子材料PVA能明显改善重组蛛丝蛋白多孔支架的性能。结论重组蛛丝蛋白-PVA复合支架材料有望在组织工程领域得以应用。【关键词】重组蛛丝蛋白；冷冻干燥；聚乙烯醇；支架Preparationofrecombinantspidersilkprotein/polyvinylalcoholcompositescaffoldmaterialWEIMei-hong,TUGui-yun,CHENDeng-long,LIMin*.*CollegeofLifeSciences,FujianNormalUniversity,Fuzhou350007,ChinaCorrespondingauthor:LIMin,Email:[e-mail]【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectsofmanyfactorssuchasporogen,denaturantandpolyvinylalcohol(PVA)polymeronthestructureandmechanicalofrecombinantspidersilkprotein/PVAcompositescaffoldmaterial.MethodsThesilkfibrousproteinsolutionwaspreparedbydissolvingtherecombinantspidersilkproteinin98%formicacid,recombinantspidersilkprotein/polyvinylalcohol(PVA)compositeporousscaffoldswerepreparedbyfreeze-drying／particle-leachingmethod.Scanningelectronmicroscopewasusedtoobservethe2conformationofthescaffolds,singlestrandstrengthtestingmachinewasusedtotestthemechanicalpropertyofthescaffolds.ResultsItindicatedthatusingethanolasdenaturant,themechanicalpropertyofthescaffoldsisbetter,thebreakingstressandbreakspecifictenacityenhances5times,thebreakingelongationratiocanreach12.21%.UsingNaCl(φ500μm)asporogen,ortheintroductionofPVAcanimprovetheperformancesofporousscaffoldevidently.ConclusionRecombinantspidersilkprotein/PVAcompositeporousscaffoldswillhaveaprospectiveapplicationintissueengineering.【Keywords】Recombinantspidersilkprotein；Lyophilized；Polyvinylalcohol；Scaffolds在组织工程中，种子细胞、支架材料以及细胞生长调节因子被称为组织工程三大基本要素[1]。其中支架材料在组织工程研究中起中心作用，它不仅为细胞、组织提供结构支撑和模板作用，还可作为活性因子的缓释载体，促进细胞的生长、分化和增殖[2，3]。寻找一种既具有良好生物相容性、生物降解性，又具有连通三维多孔结构及优良的力学性能的支架材料是组织工程的研究热点。丝纤维蛋白具有较好的生物相容性、生物降解性、韧性及高强度，可广泛应用于生物医学领域，如酶固定[4]、人造血管[5]、哺乳动物细胞培养[6]、肌腱[7]与韧带组织工程[8]等。天然蜘蛛丝是一种特殊的丝纤维蛋白，高强度、高韧性和高弹性等优良性质使其成为近年来生物医学领域研究的热点之一。天然蛛丝蛋白的获得并非易事，基因工程技术为获取重组蛛丝蛋白开拓了渠道。本室曾报道成功地将RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）三肽与蛛丝蛋白基因融合表达，从而规模化地获得重组蛛丝蛋白[9,10]。本实验以基因重组蛛丝蛋白为基础原料，采用冷冻干燥粒子滤沥法制得重组蛛丝蛋白/聚乙烯醇（PVA）复合支架材料，探讨致孔剂NaCl粒径和比例、变性剂以及PVA等因素对支架形态及性能的影响。材料与方法一、材料1.主要试剂：重组蛛丝蛋白（本室自制），98%甲酸及甲醇（分析纯，上海化3工厂）、乙醇（分析纯，广东汕头西陇化工厂）、聚乙烯醇(PVA-117、PVA-124)（分析纯，广州新易化工有限公司）。2.主要仪器:Lyolab3000冷冻干燥仪（丹麦Heto公司）、BH-2显微镜（日本Olympus公司）、KYKYAMRAY-1000B扫描电子显微镜（中国科学院仪器厂）、YP202N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）。二、方法1.重组蛛丝蛋白-聚乙烯醇多孔复合支架的制备：取一定量冻干的重组蛛丝蛋白粉溶解于98%甲酸，配成30%的重组蛛丝蛋白-甲酸溶液，与10%(w/v)PVA溶液按一定体积比混合后，再按比例（重组蛛丝蛋白与NaCl的质量比为1：1）加入NaCl颗粒，混合均匀。所得混合液倒入膜具（1cm×3cm），经55℃干燥、甲醇或乙醇变性、单蒸水浸泡沥盐、冷冻干燥，即得重组蛛丝蛋白-聚乙烯醇多孔复合支架。2.复合支架的表征:(1)扫描电子显微镜观察:支架材料表面喷金，扫描电子显微镜下观察。(2)机械性能测定:用YG001单纤维强力试验机测定支架材料的拉伸断裂比强度、拉伸断裂伸长率、拉伸断脱比功、拉伸断脱伸长率。结果1.变性剂对共混多孔支架材料力学性能的影响:分别以甲醇和乙醇为变性剂，探讨其对支架力学性能的影响，结果见表1。可看出乙醇作变性剂时，支架材料的断裂应力、断裂比强度均为以甲醇为变性剂的5倍，且断裂伸长率可达12.21%，以甲醇作变性剂时，支架的断裂伸长率仅达到10.97%。表1变性剂对共混多孔支架材料力学性能的影响T项目变性剂甲醇乙醇断裂应力（cN/mm2）7994184断裂比强度（cN/dtx）0.0620.327断裂伸长率（%）10.9712.212.NaCl颗粒大小对共混多孔支架材料力学性能的影响:以不同粒径大小NaCl颗粒做致孔剂，多孔支架材料的孔径均可以达到100μm左右，但粒径小于500μm的NaCl颗粒制得的支架孔径较为均一，连通性较好。见图1。4NaCl粒径小于500μm时多孔支架的拉伸断裂比强度σ为0.924cN/dtex，拉伸断脱伸长率为37.55%，拉伸断脱比功Wr为2.8269μJ/dtex，三个指标均比NaCl粒径大于500μm时制得的多孔支架高，说明NaCl粒径小于500μm时制得多孔支架的力学性能较好。见表2。表2NaCl颗粒大小对共混多孔支架材料力学性能的影响项目NaCl粒径＜500μmNaCl粒径＞500μm拉伸断裂比强度σ（cN/dtex）0.9240.738拉伸断脱伸长率ε(%)37.5531.09拉伸断脱比功Wr(μJ/dtex)2.82690.63813.PVA对多孔支架材料力学性能的影响：PVA-124含量只有0%时，支架的几个重要数据都无法测得，比较PVA-124含量2%和4%时，含量增高拉伸断脱伸长率、拉伸断裂比强度和拉伸断脱比功均随着增大；比较PVA-124含量4%和6%时，含量增高拉伸断脱伸长率就大；而对于拉伸断裂比强度和拉伸断脱比功，在PVA含量高时，这两个数据反而低。这说明支架中含有一定量的PVA，可以提高支架的强度。见表3。表3PVA-124用量对多孔支架力学性能的影响项目PVA-124用量(%)0246拉伸断裂比强度σ（cN/dtex）-0.6820.7900.738拉伸断脱伸长率ε(%)-22.8325.9731.09拉伸断脱比功Wr(μJ/dtex)-0.28390.93530.6381A.粒径＞500μmB.粒径＜500μm图1不同大小NaCl颗粒为致孔剂的共混多孔支架扫描电镜5注：“-”表示由于样品原因，没有测得数据4.PVA的聚合度对共混多孔支架材料力学性能的影响：就复合效果而言，PVA-124与PVA-117相比，前者拉伸断脱伸长率为25.97%，稍差于后者26.98%；但是复合PVA-124后，支架的拉伸断裂比强度为0.790cN/dtex、拉伸断脱比功为0.9353μJ/dtex，均明显高于复合PVA-117制成的支架。见表4。表4PVA的聚合度对共混多孔支架材料力学性能的影响项目PVA-117PVA-124拉伸断裂比强度σ（cN/dtex）0.4980.790拉伸断脱伸长率ε(%)26.9825.97拉伸断脱比功Wr(μJ/dtex)0.50510.9353讨论醇类作为凝固剂，可以诱导β折叠构象的形成，其中以甲醇和乙醇最为常用。因甲醇有较强的毒性，对人体的神经系统和血液系统影响大，它经消化道、呼吸道或皮肤摄入都会产生毒性反应，甲醇蒸气能损害人的呼吸道黏膜和视力，所以考虑能否以乙醇代替甲醇作为凝固变性剂。本实验比较了分别以甲醇、乙醇为变性剂，制得支架材料力学性能的差异。以乙醇为变性剂制得支架材料的断裂应力、断裂比强度均约为以甲醇为变性剂的5倍，且断裂伸长率可达12.21%。这可能是因为乙醇的R基团大，诱导β折叠结晶区的形成缓慢，分子排列整齐产生的分子应力也较大，所以制得支架材料力学性能好。以不同颗粒大小致孔剂制得的多孔支架，它们的孔径约100μm以上，均能满足一些细胞生长的要求。以NaCl晶体为致孔剂的多孔支架力学性能稍好，这可能是因为晶体颗粒小，支架内部分子(蛋白质和PVA-124)接触反应机会比较多，所以力学性能好；相反地，NaCl颗粒大，由于互相之间的排挤，造成支架内部分子(蛋白质和PVA-124)接触反应少，势必会造成力学性能变差。单独重组蛛丝纤维制备支架材料韧性不够，所以期望通过与其它聚合物混合改善性能。PVA是一种含有大量羟基的聚合物，羟基是强亲水基团，因此PVA是水溶性高分子。PVA具有很好的成膜性、耐磨性、耐化学腐蚀性、可生物降解等良好性能，从而被广泛研究试图应用于人工关节、人工血管、药物缓释体系等生物医学领域。本实验试图用PVA聚合物来改善丝纤维的性质。结果表明，添加一6定量的PVA能提高薄膜的强度，这可能是因为PVA通过分子中的羟基与蛋白质分子形成氢键或其它共价键，使分子间作用力增强，所以抗拉强度就大。PVA的聚合度间接体现其分子量的大小，分子量的不同可能导致支架材料力学性能的改变。本实验考察两种聚合度的PVA（PVA-117和PVA-124）对支架力学性能的影响，实验结果表明PVA-124共混改性效果优于PVA-117。这是因为PVA-124分子量较高，分子主链较长，其较长的分子链与蛋白分子链之间的相互缠绕作用更强，拉力作用下，它的抗拉能力更强。总之，重组蛛丝蛋白与高分子材料PVA共混可以明显改善重组蛛丝蛋白多孔支