各种染色方法及应用

染色方法革兰氏染色瑞-吉染色细胞化学染色免疫组化染色革兰氏染色与细胞壁C.Gram（革兰）于1884年发明的一种鉴别不同类型细菌的染色方法。革兰氏染色革兰氏染色1、用碱性染料结晶紫对菌液涂片进行初染2、用碘溶液进行媒染，其作用是提高染料和细胞间的相互作用从而使二者结合得更牢固。3、用乙醇或丙酮冲洗进行脱色。在经历脱色后仍将结晶紫保留在细胞内的为革兰氏阳性细菌，而革兰氏阴性细菌的结晶紫被洗掉，细胞呈无色。4、用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对涂片进行复染。例如复红，它使原来无色的革兰氏阴性细菌最后呈现桃红到红色，而革兰氏阳性细菌继续保持深紫色细胞化学染色，是一种以形态为基础，结合运用化学或生物化学技术对血细胞内各种化学成分作定位、定性及半定量分析的方法。用于研究血细胞生理、病理和化学结构；临床上为某些血液病的诊断、鉴别诊断、疗效观察、预后监测和发病机制的探讨，提供重要依据。细胞化学染色血细胞化学染色的基本要求是在原位显示细胞成分和结构，反应产物应是有色沉淀物，具有一定的稳定性。血细胞化学染色可显示糖原、脂类、酶、蛋白质等。（一）固定固定有物理法与化学法，物理法为干燥和火焰固定，化学法最常用的是甲醛、乙醇、丙酮和醋酸等。血细胞化学染色流程（二）显示1、偶氮偶联法：利用人工合成的酶底物，在酶作用下，产生分解产物，再与重氮盐结合引起偶氮偶联，使其形成不溶性的偶氮色素，以此证明酶的存在。2、联苯胺法：粒细胞和单核细胞中的过氧化物酶作用于过氧化氢，释放新生态氧，使无色的联苯胺形成蓝色沉淀。3、普鲁士蓝法：细胞内、外铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成蓝色亚铁氰化铁沉淀。4、雪夫反应：过碘酸氧化细胞内糖类中乙二醇基形成乙醛基，醛基与雪夫试剂作用，使无色品红形成红色沉淀。5、金属沉着法其他尚有物理学方法，如脂溶性染料染色（显示脂质）、荧光显示、放射自显影以及体外活体染色亦常用于临床血液细胞学诊断。（三）细胞化学定量粗略估量，以染色反应的强弱，受色的深浅，人为地区别为阴性和各种程度的阳性。百分法，只能反映细胞阳性率，不能反映受色强弱。积分法，是常用的半定量法，将等级估量与百分率相结合它既反映了细胞阳性率的高低，又反映了细胞受色的强弱。下面介绍几种常用的细胞化学染色方法，这些方法学在白血病的鉴别诊断上具有重要意义。一、过氧化物酶染色（POX）【原理】粒细胞和单核细胞的胞浆内的髓过氧化物酶（POXorMPO）分解过氧化氢，释放新生态氧，使无色联苯胺氧化成蓝色联苯胺，后者进一步变成棕色化合物沉着于细胞质内。M1-POX(+)×过氧化物酶染色临床意义主要用于鉴别急性白血病类型，急性髓细胞白血病多呈阳性反应，以M3和M2型反应最强，MI和M5型反应较弱，故有助于区别M3和M5型。急性淋巴细胞白血病呈POX阴性反应，故为急性髓细胞和淋巴细胞白血病鉴别的重要指标。二、过碘酸一雪夫（PAS)染色【原理】胞浆内存在糖原或多糖类物质（如粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等）中的乙二醇基（CHOH-CHOH）经过碘酸（periodicacid）氧化，转变为二醛基（CHO-CHO），与雪夫(Schiff)试剂中的无色品红结合，形成紫红色染料而沉积于胞浆中。该反应称为过碘酸一雪夫(PAS)阳性反应。L1PAS(+)AML-M6PAS(+)【临床意义】（1）M6与巨幼贫的鉴别M6的幼红细胞PAS可呈强阳性，积分明显增高，巨贫、再障、溶贫时PAS反应为阴性。（2）急性白血病的类型鉴别ALL，PAS呈大块状阳性，也可是阴性，AML为阴性，急性单核细胞白血病时原单核细胞及幼单核细胞PAS阳性，积分增高，阳性颗粒小而多，呈弥散分布。三、骨髓铁染色【原理】正常人骨髓中的贮存铁主要存在于骨髓小粒和幼红细胞中，骨髓中的铁在酸性环境下与亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝反应，形成蓝色的亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位，从而反映骨髓中铁的储存量。细胞外铁细胞内铁环形铁粒幼细胞【临床意义】骨髓铁染色是诊断缺铁性贫血及指导铁剂治疗的重要方法；也是诊断铁粒幼细胞贫血的有效方法。【基本原理】免疫组化是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。免疫组(织)化(学)1.阻断内源性过氧化物酶活性2.加封闭液：3.加入一抗（保存液稀释）4.加入二抗（即免疫组化试剂盒里的）5.显色6.封片免疫组化步骤免疫组化技术的优点1、特异性强2、敏感性高3、定位准确、形态与功能相结合34流式细胞术35流式细胞术（FLOWCYTOMETRY）是利用流式细胞仪检测细胞或其它颗粒性物质的物理、化学特性。它借鉴了荧光显微镜技术与血球计数原理,同时利用荧光染料,激光技术,单抗技术以及计算机技术的发展,大大提高了检测速度与统计精确性,而且从同一个细胞中可以同时测得多种参数,为生物医学与临床检验学发展提供了一个全新的视角和强有力的手段。流式细胞术37常用荧光染料的特性荧光染料激发波长(nm)发射波长(nm)用途颜色FITC488525免疫荧光绿色PE(RD1)488575免疫荧光橙色ECD488620免疫荧光橙红PeCy5488675免疫荧光红PI488620DNA染色橙红PECy7488755免疫荧光深红PerCP488670免疫荧光红TO488525RNA染色绿38PNH(阵发性睡眠性血红蛋白尿)方法特点备注蔗糖溶血试验(糖-水试验)主观性强，干扰因素多，假阳性高其它类型的溶血性贫血，甚至急性白血病患者也为阳性可鉴别出PNHI,PNHIIPNHIII型，但灵敏度较低酸溶试验(HAM测试)特异性高,但主观性强,灵敏度低乙酰胆碱脂酶活性白细胞减性磷酸酶活性尿血铁黄素网织红细胞计数流式细胞术法(CD55/CD59)客观，准确，灵敏度高(1%)PNH诊断的金标准检测PNH方法学39HbF(胎儿血红蛋白)检测F细胞胎儿红细胞地中海贫血诊断胎-母溶血(FMH)镰刀细胞贫血确定抗Rh抗体使用的必要性和用量脊髓发育不良综合症遗传改变应用40血小板计数新标准(双平台法)R=红细胞数R3/血小板数R1(流式)血小板数=红细胞数(血球仪)/R(国际血液学标准化委员会(ICSH)/国际实验血液学协会(ISLH)2001)灵敏度高(1-400x109/L)，重复性好，室内/室外变异系数均很小尤其应用于血小板预输注病人的检测(阈值:20x109/L)谢谢！