基因工程第6章 DNA重组的操作1

Review第三部分目的基因的分离目的序列已知：一般采用PCR技术或分子杂交技术分离克隆目的基因目的序列未知：差异表达序列无差异表达的目的序列，可采用文库筛选法、功能蛋白分离法、序列克隆法一、目的基因的功能克隆根据蛋白质的基本生化特性这一功能信息，在获知基因的功能后克隆其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库，然后从文库中筛选目的基因(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序，据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针，从cDNA表达文库中筛选相应克隆。二、序列克隆法根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因采用核酸探针杂交筛选或用PCR技术进行分离三、差别杂交法适用范围：组织特异性表达或特定发育阶段表达的基因受生长因子调节的基因经特殊处理诱导表达的基因应用前提：基因在两种不同的细胞群体中的差异性表达（一个细胞群体中正常表达，另一个细胞群体中目的基因不表达）。基本过程制备两种细胞群体的的mRNA提取物以两种总mRNA或cDNA为探针以表达目的基因的细胞群体构建cDNA文库有目的基因表达的mRNA探针，重组体菌落阳性反应目的基因不表达的mRNA探针，除目的基因之外，其余菌落都为阳性反应比较底片，对照原板，可挑选出含选目的基因的菌落cDNA文库母板目的基因有表达目的基因无表达无有无有说明含目的基因说明含目的基因四、减法杂交技术又称差减杂交、扣除杂交、减数杂交、消减杂交本质：尽量去除两种样品中普遍共同存在的基因序列，从而使目的基因序列得到有效的富集，从而提高基因筛选分离的敏感性两种策略：mRNA减法杂交基因组减法杂交mRNA减法杂交提取表达目的基因的细胞mRNA，反转录成cDNA提取不表达目的基因的细胞mRNA过量杂交两种组织中均表达的基因产物形成cDNA/mRNA杂交分子特异mRNA反转录的cDNA片段仍保持单链减数杂交技术分离差异表达基因DNA/RNA杂交分子可结合在羟基磷灰石柱上，而游离的单链cDNA则过柱流出。回收的cDNA转变为双链cDNA后克隆倒适当的载体中，就成为一个减数文库。五、mRNA差别显示技术又称为差别显示反转录PCR（DDRT-PCR）目的序列未知，1992年由美国哈佛大学医学分校Dena-Farber研究所的两位科学家Liang和Pardee首次提出的，并运用这种方法来分离一对培养的哺乳动物细胞中差别表达的基因。至今，运用mRNA差别显示技术分离、鉴定的差别表达基因大约有300多个。3’端锚定引物锚定引物的通式是oligo(dT)12MN，其中M为A、C、G中的任意一种，N为A、C、G或T中的任意一种，所以共有12种oligo(dT)12MN引物，用这12种引物分别对同一总RNA样品进行cDNA合成，即进行12次不同的反转录反应，每一种3’端锚定引物，都能够把总mRNA群体的1／12分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。这样可以将整个mRNA群体在cDNA水平上，分成大致相等但序列结构不同的12份亚群体。这一过程叫做差异显示反转录，即DDRT。5’端随机引物另外，还需要另外一种由10个核苷酸组成的5’端随机引物。这种5’随机引物可以同特定细胞类型的总mRNA群体中的一部分分子发生杂交作用，而且杂交部位是随机地分布在距每条新合成的cDNA链3’端的不同位置上。用3’端锚定引物和5’随机引物组成的引物对，以mRNA/cDNA为模板进行PCR扩增，然后经过2～3h的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，可以显示出在100～500bp之间的DNA条带20种5’端随机引物12种3’端锚定引物240组引物，进行PCRPCR过程中加入放射性标记变型聚丙烯酰氨凝胶电泳放射自显影显示差异表达条带对差异表达条带进行割胶回收并制备成探针，从文库中筛选差别显示分析基本流程基本程序提取两种细胞的总mRNA,反转录后成为2种cDNA以一定的引物作随机聚合酶链反应通过扩增产物的电泳分析,分离出不同样品间的差异条带将差异DNA做成探针在cDNA文库或基因组文库中筛选基因并作功能分析优点：几乎可检测细胞表达的所有基因可同时比较多种细胞类型可同时展现所有差异用量少，操作简单，快速高效缺点：12种锚定引物和20种随机引物，240次PCR聚丙烯酰胺凝胶电泳分离片段小于500bp有些差别条带成簇出现，造成假阳性缺乏定量分析手段，判断差异条带有难度第六章DNA重组的操作第一节受体细胞易于重组DNA分子的导入能使重组DNA分子稳定存在于细胞中便于重组体的筛选遗传稳定性高安全性高有利于外源基因的高效分泌表达在遗传密码的应用上无偏倚性具有较好的转译后加工机制有较高的应用价值1、原核生物细胞是较为理想的受体细胞大多原核生物没有坚硬的细胞壁没有核膜，有利于外源片断重组基因组简单，便于对外源基因进行遗传分析多为单细胞生物，繁殖迅速，过程简单缺陷：以原核生物表达真核生物基因存在问题，很多真核生物基因不能在E.coli中表达具生物活性的功能蛋白。缺乏真核生物蛋白质折叠复性系统缺乏蛋白质加工系统原核生物内源蛋白易降解空间构象不正确的异源蛋白，造成表达产物不稳定常用受体菌：大肠杆菌人胰岛素、生长素、干扰素等枯草杆菌人β干扰素、白细胞介素乙肝病毒核心抗原等蓝藻易于表达植物基因2、真菌细胞低等真核生物酵母菌：以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核微生物，易于表达外源真核基因基因结构最为简单的真核生物之一具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统不含有特异性病毒，不产生毒素培养简单可将外源基因表达产物分泌至胞外3、植物细胞坚硬的细胞壁纤维素酶处理－原生质体摄取外源片断全能性：在合适的培养条件下，一个分离的活细胞可分化成植株。水稻，棉花，玉米，马铃薯，烟草等4、动物细胞早期：生殖细胞、受精卵细胞或胚细胞现在：体细胞培养动物：猪、羊、牛、鱼、鼠、猴等生产天然状态的复杂蛋白质动物疫苗动物品种的遗传改良人类疾病的基因治疗第二节重组体导入受体细胞2.1重组质粒DNA转化大肠杆菌转化（transformation）定义转化微生物的种类感受态细胞P139转化过程供体（donor）：提供DNA的生物受体（recipientorhost）：获得DNA的生物1.定义转化：受体菌直接吸收供体菌的DNA片断而获得后者部分遗传性状的现象。转化子（transformant）：通过转化方式而形成的杂种后代。2.转化微生物的种类首次发现转化现象肺炎链球菌（Griffith,1928）嗜血杆菌属、芽孢杆菌属、奈瑟氏球菌属、根瘤菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属等。3.感受态（competence）感受态：指受体细胞最易接受外源DNA片断并能实现转化的一种生理状态。感受态是细菌的一种遗传特性，而且也受生长阶段、培养条件的影响。肺炎链球菌对数生长后期芽孢杆菌属指数期末和稳定期大肠杆菌刚进入对数期DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右大肠杆菌革兰氏阴性菌细胞表面的结构和组成与革兰氏阳性菌不同转化因子的吸收较为困难人工制备感受态细胞4.转化过程大肠杆菌的转化方法：Ca2＋诱导大肠杆菌转化法电穿孔转化法三亲本杂交接合转化大肠杆菌1、Ca2＋诱导大肠杆菌转化法培养生命活动旺盛的菌体菌种分纯活化，扩大培养，处于对数生长期沉淀菌体冰水浴中预冷10分钟，4℃离心化合物处理含CaCl2无菌预冷缓冲液处理DNA分子转化感受态细胞制备感受态细胞的注意事项1.细胞生长状态和密度:不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或－20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。2.质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。3.试剂的质量:所用的试剂,如CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或AR.)，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。4.防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。感受态细胞的制备1、挑取平板上的大肠杆菌单菌落接种于2mLLB液体培养基中，37℃振荡培养过夜2、按1％的接种量接种于3mL新鲜LB培养液，37℃剧烈振荡培养至OD600为0.4-0.6(可见雾状)3、倒至1.5mL的eppendorf管中,4℃下12,000rpm离心1min，倒出培养液，用无菌滤纸尽量吸干4、加入1mL预冷的无菌0.1mol·L-1CaCl2溶液涡旋，4℃下12,000rpm离心30秒,尽量去除上清5、沉淀以50-100μL预冷的0.1mol·L-1CaCl2重悬，4℃保存备用，7d内可用。细胞的转化2ul重组DNA50ul感受态细胞混匀＋↓冰浴30min42℃热激90～120S↓↓冰浴2min复苏：加入450ul液态LB培养基，37℃轻缓振荡培养（150rpm），1.5～2h↓→取30～50ul，涂布在含相应抗生素的培养基上，平板培养挑取单菌落，于含相应抗生素的液态培养基培养后，取一定量提取质粒，进行鉴定（酶切、杂交、测序等）↑CaCl2的诱导原因：在0℃的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，Ca2＋使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中部分核酸酶解离，诱导形成感受态Ca2＋能与加入的DNA分子结合，形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物，黏附在胞膜的外表面；42℃热激处理，细胞膜的液晶结构发生扰动，出现间隙。提高转化效率的因素：MgCl2与CaCl2共同处理二甲基亚枫（DMSO）、二硫苏糖醇（DTT）提高100～1000倍，易污染RbCl、MnCl2、LiCl和KCl等与CaCl2多盐处理对照处理：DNA对照处理：无菌水代替感受态细胞，检验DNA溶液感受态细胞对照处理：NTE缓冲液代替DNA溶液，检验感受态细胞感受态细胞有效性对照处理：加入已知的容易转化的质粒DNA原因：转化处理过程中，可能感染杂菌，导致假阳性2、电穿孔转化法（P140）基本原理：利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间通道，促进外源DNA的有效吸收。影响因素：电场强度，电脉冲时间，外源DNA浓度菌体制备冷却，离心，洗涤（降低离子强度）10％甘油重悬细胞，-70℃贮存低温下（0－4℃）进行电穿孔转化3、三亲本杂交接合转化大肠杆菌根据非接合质粒的迁移作用而建立，目前常用的载体多是在非接合型质粒或缺少了接合转移基因的接合型质粒的基础上而构建的。待转化的受体菌含有要转化的重组质粒的供体菌含有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌（如：辅助菌株E.coli(pRK2013)）4、转化率：DNA分子转化受体菌获得转化子的效率以转化子数与用于转化处理的DNA分子数或质量的比率表示以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表示P150影响转化率的因素：重组DNA分子质量较小，亲和性强，双螺旋闭合结构受体细胞受体细胞的选择非常重要转化手段电穿孔法Ca诱导法三亲本杂交法2.2重组λDNA分子转导大肠杆菌转染：将重组λDNA分子直接导入受体细胞的过程。转导：通过λ噬菌体颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分