几种酵母转化方法

几种酵母转化方法酵母转化原理：像酿酒酵母,线性化的转化DNA和Pichiapastoris基因组的同源区域发生同源重组,使得线性化DNA产生稳定的转化子（Creggetal.,1985;Creggetal.,1989）.这样的整合方式显示极强的稳定性,即使多拷贝转化子在没有选择压力的情况下也很稳定.单交换事件（插入）比双交换事件（置换）发生几率更大.单插入事件中约发生1-10%概率的多插入事件.电转化注意点：一、制备感受态的菌液收集时间：1、准确测定OD值：OD在1.2～1.5之间。1）为了准确测定OD值，建议将菌液稀释不同浓度测定（1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系）。每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能OD稀释倍数不够！2）OD值是否测准也可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min）约0.95g/10ml。高密度发酵时菌体湿重将相应下降。2、75ml的菌，经18h左右的培养，最后sorbital洗涤完毕后，50ml离心管里所剩菌体特别浓，需要1mlsorbitol才可溶解为糊状。正常培养的OD在1.2～1.5之间的500ml菌液，收集的感受态也用1ml稀释的，没那么粘稠。可以看看降低培养温度（27摄氏度）或缩短培养时间（12h）。3、甚至不用转接,直接挑单克隆在50－100mlYPD中摇过夜，效果也很好二、制备感受态的菌液量如果只转一个样品，50ml就够了，一般50ml的培养液如果OD值正常的话够做10管感受态的，其他的按比例缩小。用大试管摇5ml菌液，然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受态，每一步的离心时间30秒就行。整个流程时间短，制备好的感受态用来做转化的效率很高。山梨醇离心，洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度，不要过于粘稠和稀释。三、感受态的保存感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因，在冰上放几个小时再做可能有一定的影响，尽量马上制备马上转化。如果感受态细胞要保存，不需要加甘油，一般80ulEP管分装，-70或-80摄氏度保存。另附：酵母GS115点种分离纯化接种GS115于5mlYPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布YPD平板，30℃培养48小时，用YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。四、电转化注意点：1、感受态做好后，最后一次吸出sorbital时，不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。2、最后用毛细管取出100ul出来，加入质粒，混匀！（怕量不够，吸得很多，电转时效果反而不好。）3、电转杯清洁处理:一般先冲洗，洗净；然后浸泡在75%的乙醇中；使用前我们都是放在超净台上，开启紫外，边吹风晾干，边进行紫外照射。电转杯的新包装或重复使用可能对转化率有一定的影响。4、电击的时候，电压数以及电击时间可以摸索一下，适当增加电压或者延长电击时间都可以。电击条件比如1.5kv，放电4.8～5.5ms。电击所有过程都要尽量在冰上进行，电击时间可以减少一点，设置为5ms左右，电击之后马上加入预冷的山梨醇溶液，转移至EP管，30度静止培养1h。如果菌体悬液浓度比较大的时候，在制备感受态的时候要留心一下操作中的问题了。5、电击之后，加入1ml的山梨醇，吸入1.5ml的ep管中，置于30度摇床低速培养1h，再涂板。6、注意的是处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。7、转化后1ml用sorbitol重悬的细胞悬液不能全部涂在一块板子上，按标准程序制作的感受态一般3块左右可能比较合适，以干燥后看见一薄层淡淡的白色为宜。转化子会在白色的薄层上长出圆韵、饱满的大菌落的。五、转化试剂和培养基的正确准备方法1、MD板子提前几天做好，放在冰箱里，涂板的时候吸收效果会好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些积层，反而不利于生长。2、YNB42度水浴一会，然后过滤除菌，YNB是加到培养基里面的，去离子水pH偏低，建议直接用蒸馏水就可以（关系不是太大）。3、山梨醇，以及无菌去离子水均是冰冻，存放在4度冰箱中4、一般用10ug以上质粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ulddH2O重溶。转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。有人用LiCl和DTT处理细胞，转化效率很高，可以试试。建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。5个电转化方案方法一：高效1.收集菌体取1mlGS115过夜培养物（OD约6-10）分装到1.5mlEP管中，4℃、10000g离心1min，弃上清，沉淀用无菌水（4℃）洗涤，同样条件下离心，弃上清。2.菌体处理加入1ml处理液，室温下放置20min。处理液：10mMLiAc10mMDTT0.6Msorbitol10mMTrisHCl（pH7.5）3.离心，弃上清，加入1ml1Msorbitol，离心，弃上清，4.用1Msorbitol洗涤二次，到最终体积约为80μl.（菌体太多可适当弃去部分）5.加入10μl.经过BglⅡ酶切处理的工程质粒，混匀后转入电击杯中，冰浴5min.6.电转.1.5kv，25μF，200Ω条件下进行电转。7.电击后立刻加入1mL1Msorbitol，吸出后于30℃培养2h。8.取一定量涂平板（YPDS+Zeocin，涂布的量分别为100、200微升，剩余的经离心处理后全部涂在一个平板上）有一点要注意的是处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。方法二：按下面步骤转化,开始每个板子只长了一二十菌落;小细节修改后,每个板长了约100个.步骤如下：1、目的DNA（pPIC9K），经电泳检测已经线性化（SalI酶切）；2、DNA纯化方法是经酚仿－氯仿两步抽提后，无水乙醇沉淀的，目测定量应足够；3、GS115甘油菌经新鲜平板复苏后，5ML培养过夜，16h左右后，取菌1：100稀释，接种于70ml菌液扩大培养，14h后测得OD600约1.3左右。4、将sorbital、水和菌液均冰浴；5、菌液离心5min－100ml冰水洗涤－50ml冰水洗涤－4mlsorbital洗涤，然后溶解于300ul冰sorbital；6、加入约5～10ug的DNA，枪吹匀，置0.2CM电转杯静置5min；7、电击，1,5KV.8、立即加入1ml冰浴的sorbital，静止10min。9、取100ul转化液，涂布10cm的MD平板。做了一点修改每块板子大概能长100来个菌落（一般需要2天左右）：1、菌液收集时间：以前可能是OD值测得不太准确，我然后把菌液分别做了1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系。1、菌液测OD值时，建议将菌液稀释不同浓度测定，这样才准确些。菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能就是你的OD稀释倍数不够！你分别稀释2倍、4倍、8倍、10倍等，每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！2、我开始是先挑单克隆于5mlYPD中，过夜16h后，转接于50mlYPD中，培养大概18个小时吧。OD值是否测准可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min）约0.95g/10ml。高密度发酵时菌体湿重将相应下降。[测OD，用什么作空白对照呢？菌体稀释液，我一般使用PBS]3、电击条件等上面帖子上都有，1.5kv，放电4.8～5.5ms。2、其它做法相同，就是感受态做好后，最后一次吸出sorbital时，不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。3、最后用毛细管取出100ul出来，加入质粒，混匀！（我以前怕量不够，吸得很多，电转时效果反而不好。）4、MD板子提前几天做好，放在冰箱里，涂板的时候吸收效果会好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些积层，反而不利于生长。5、你说的YNB，我用的是成品，只需要直接配制。42度水浴一会，然后过滤除菌。我没有加硫酸铵。YNB是加到培养基里面的，去离子水pH偏低哦，我建议直接用蒸馏水就可以了（关系不是太大）。方法三：简便独特在筛选高表达菌种中，与大多数人和说明书有区别（成功做出几个基因）:每次转化前，均用多种酶BlgII/salI/sacI同时切，转化时，用GS115/KM71/KM71H同时转化，转化的条件也和大家一样，即1.5/25/200,但是我用的是0.1的杯子，不是0.2的，转化后涂MM及YPD+0.25G，长出菌落后，即进行大规模的表达试验，直接用YPD表达的，一般48h后即进行大量的SDS-PAGE鉴定，鉴定时，样品不用浓缩，直接上样，看到目的带后再做PCR，测序。方法四：没有转化子（无aa的YNB和硫酸铵称好后，去离子水溶解，然后高压灭菌）1.挑取酵母单菌落，接种至含有50mlYPD培养基的三角瓶中，30℃、250-300rpm培养过夜约14h，OD600约1.32.菌液离心5min－50ml冰水洗涤－25ml冰水洗涤－2mlsorbital洗涤，然后溶解于200ul冰sorbital；两管分装，每管100ul3.加入约5～10ug的线性化的DNA20ul，枪吹匀，置0.2CM电转杯冰浴5min；4.电击，1,5KV.使用的是Eppendorf2510，用于转化细菌及酵母。5.立即加入1ml冰浴的sorbital，静止1h。将菌体悬液涂布于MD平板上，每300µl涂布一块平板；方法五:和说明书差不多的方法X33菌株于100mlYPD摇到OD600约1.1-1.3，太高影响感受态效率（1）1500－1700g离心5min，将离心管倒置在吸水纸上轻轻控几下，充分弃上清（2）加入100ml冰浴的超纯水ddH2O，可在振荡器上振荡混匀，可静置3－5分钟（3）离心，弃上清，再加100mlddH2O洗一遍（4）离心，弃上清，加20ml冰浴1MSorbitol洗一遍（5）离心，弃上清，菌体置于冰浴中，加入约100－200ulSorbitol混匀加入Sorbitol量需自己调整，这时菌液很浓，只要能够用200ul黄枪头吸出来就可以了，一般共有约400－500ul，够做几管感受态了。（7）吸取100－150ul感受态到线性化的DNA中，用枪头打匀或手指弹匀静置5min，于2mm电转化杯中，电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400），一般放电时间在4.5-4.9ms之间，小于4说明你的DNA盐浓度太高（9）立即加入1mlSorbitol，转入10ml离心管，30度静置1小时，然后加入1mlYPD，30度，200rpm摇1小时，取50－200ul菌液涂100ul/mlYPDS板（10）一般转化效率可以达到：200个以上转化子每200ul菌液，足够筛选表达菌株了。方法六:酵母感受态细胞的制备⑴接种PichiapastorisGS115于5mlYPD液体培养基，30℃，250~300250rpm，过夜。⑵取200µl的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的三角摇瓶中，28~30℃、250~300r/min培养过夜，一般12小时左右。⑶将细胞培养物于4℃，5000g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；⑷按步骤3离心，用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；⑸按步骤3离心，用20ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；⑹按步骤3离心，用1ml的冰预冷的1M的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为2ml；⑺NOTE：可将其分装为200µl一份的包装冷冻起来，但如果保存时间过长会影响其转化效率。化学转化毕氏酵母氯化锂转化法试剂1.1MLiCl：用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释2.50%PEG3350：SigmaP3640用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装3.2mg/mlsalmon