实验二十五基因重组实验Ⅳ——重组体的筛选与鉴定

实验二十五基因重组实验Ⅳ——重组体的筛选与鉴定[原理]限制性内切核酸酶酶切鉴定：具体原理见实验二十一。PCR反应鉴定：具体原理见实验十八。[试剂]1、DNA模板2、引物3、TaqDNA聚合酶4、dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）5、10×PCR反应缓冲液：100mmol/LTris-HClpH8.3，500mmol/LKCl，15mmol/LMgCl2，0.1%明胶6、矿物油1、超纯水8、EcoRI酶解反应液（10×）:1mol/LpH7.5Tris-HCl,0.5mol/LNaCl,0.1mol/LMgCl2。9、HindIII酶解反应液（10×）：1mol/LpH7.4Tris-HCl,1mol/LNaCl,0.07mol/LMgCl2。3.50×TAE电泳缓冲液：称取242克Tris，加入57.1ml冰乙酸，100ml0.5mol/LEDTA，调节pH至8.0，加蒸馏水至1000ml。10、.凝胶加样缓冲液：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、40%蔗糖水溶液（w/v）。11、1%（1.5%）琼脂糖凝胶：1×TAE100ml含1g（1.5g）琼脂糖。[器材]1、DNA扩增仪2、电泳仪、电泳槽13、微量移液器4、紫外投射仪5、0.5ml塑料离心管6、样品槽模板（梳子）7、锥型瓶（100ml或50ml）8、一次性塑料手套9、凝胶成像系统[操作步骤]1.酶切反应体系的建立（20μl反应体系）按下表要求配制酶切反应体系质粒DNA6μl10×Buffer2μlHindIII1μlH2O10μlEcoRI1μl混匀后置37℃水浴3h。2.PCR反应体系的制备(25μl反应体系)按下表要求配制酶切反应体系DNA2μl10×Buffer2.5μldNTP0.1μlH2O17.2μlPrimer-10.1μlTaqE1μlPrimer-20.1μl50%甘油2μl混匀后，2000rpm离心30sec，然后按94℃5min94℃40sec55℃40sec35cycles72℃90sec72℃3min3.电泳：1%琼脂糖凝胶（酶切）和1.5%琼脂糖凝胶（PCR反应）将20μl酶切和PCR产物进行电泳，观察结果。2VocabularyinBiochemicaltechnologyAAbsorbance吸光度Absorbent吸附剂Absorptionchromatography吸附层析Absorptionspectrum吸收光谱Acrylamide,Aa/Acr丙烯酰胺（单体）Adenine,A腺嘌呤Affinitychromatography亲和层析Agarose琼脂糖Agarosegelelectrophoresis，AGE琼脂糖凝胶电泳Allelespecificoligonucleotide,ASO等位基因特异性寡核苷酸杂交Ammoniumpersulfate,AP过硫酸胺Anglerotor角式转头Anionexchangechromatography阴离子交换层析CCarrierampholyte载体两性电解质Cationexchangechromatography阳离子交换层析Celluloseacetatemembraneelectro-phoresis，（CAME）醋酸纤维薄膜电泳Celluloseion-exchangers纤维素离子交换剂Centrifuge离心机Centrifugalforce离心力Centrifugaltechnique离心技术Coenzyme辅酶Columnchromatography柱层析Cytosine,C胞嘧啶DDenaturegradientgeleletro-phoresis,DGGE变性梯度凝胶电泳Deoxyribonucleicacid,DNA脱氧核糖核酸Dialysis透析Differentialcentrifugation差速离心3DiscontinuousPAGE不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳EEletro-osmosis电渗Emissionspectrum发射光谱Exclusionchromatography排阻层析GGelchromatography凝胶层析Gelfiltration凝胶过滤Guanine，G鸟嘌呤HHomogenizer匀浆器Holozymase全酶IIon-exchangechromatography离子交换层析Ion-exchangegel离子交换凝胶Ion-exchangeresin离子交换树脂Isoelectricfocusing,IEF等电点聚焦Isoenzyme同工酶LLigand配基MMeltingtemperature,Tm溶解温度Matrix载体Mobilephase流动相Molecularsievefiltration分子筛过滤NN,N,N’,N’-methylencBisacrylamide,BisN,N,N’,N’-四亚甲基双丙烯酰胺N,N,N’,N’-tetramethylethylenedi-amine,TEMED四甲基乙二胺4OOsmosis渗透PPaperchromatography纸层析Partitionchromatography分配层析Partitioncoefficient分配系数Photoelectriccolorimetry光电比色法Plasmid质粒Polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE聚丙烯酰胺凝胶Polymerasechainreaction,PCR聚合酶链反应Primer引物RRelativecentrifugalforce,RCF相对离心力Restrictionendonuclease，RE限制性内切酶Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP限制性片段长度多态性Ratezonalcentrifugation速率区离心法Reverseosmosis反向渗透Revolutionperminute,rpm每分钟转速Ribonucleicacid,RNA核糖核酸Rotor转头SSaltingin盐溶Saltingout盐析Saphadex葡聚糖凝胶SDS-PAGESDS-聚丙烯酰胺凝胶Sedimentationcoefficient沉降系数Sedimentationvelocity沉降速率Sedimentationtime,ST沉降时间Sepharose琼脂糖凝胶Sequencing测序Singlestrandconformativepolymorphism,SSCP单链构象多态性Sodiumdodecylsulfate,SDS十二烷基硫酸钠5Spectrophotometer分光光度计Spectrophotometery分光光度法Stationaryphase固定相Swing-outrotor水平式转头TThin-layerchromatography,TLC薄层层析Transmittance透光率Thymine,T胸腺嘧啶Transformation转化Transfection转染Transduction转导Transposition转位UUltrafiltration超滤Uracil,U尿嘧啶VVisibleandultravioletSpectro-photometery紫外可见分光光度法Vector载体