实验四__重组蛋白的SDS-PAGE

实验四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量1实验目的1.1通过本实验学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法的基本原理。1.2初步掌握应用此法测定蛋白质分子量的操作技术。纸电泳琼脂糖电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳毛细管电泳native-PAGESDS-PAGEIEF-PAGE2D-PAGEclassification2实验原理SDS－PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳），1967年由Shapiro等建立1969年由Weber和Osborn进一步完善用于测蛋白质亚基分子量聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及有关特性聚合反应聚丙烯酰胺是由单体(Acr)、交联剂(Bis)，在催化剂(AP或核黄素)和加速剂(TEMED)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。①丙烯酰胺（Acr）：是凝胶的最主要成分，单体聚合形成长链。②甲叉双丙烯酰胺(Bis)：是交联剂，将聚丙烯酰胺链交联成三维网状结构。③过硫酸铵(AP)或核黄素(Vb2)：提供自由基，引发聚合反应。④四甲基乙二胺（TEMED）：是加速剂，它催化过硫酸铵形成自由基。对核黄素引发的光聚合也有加速作用。化学聚合：使用AP作催化剂，常用于制备分离胶（小孔胶）。过量氧会影响链的延长和聚合，所以过硫酸铵(AP)催化的化学聚合要水封以隔O2。光聚合：使用核黄素作催化剂，聚合反应需光照，适用于制备浓缩胶(大孔胶)。应控制AP和TEMED的用量，使凝胶在40min-1hr之间聚合完全为宜。凝胶浓度与孔径的关系：T浓度大，孔径小，移动颗粒穿过网孔阻力大。T浓度小，孔径大，移动颗粒穿过网孔阻力小。1样品浓缩效应(1)凝胶孔径不连续性(2)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性(3)电位梯度的不连续性(1)凝胶孔径不连续性:浓缩胶T=5%孔径大分离胶T=7%－15%孔径小在2层凝胶交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。(2)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性:Tris:缓冲配对离子，维持溶液的电中性及pH值Cl-:在电场中迁移率快，前导离子(leadingion)，快离子。Gly:其pI=6.0，在pH6.7的浓缩胶缓冲体系中，甘氨酸解离度很小，因而在电场中迁移很慢，称为尾随离子（trailingion），慢离子。当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质;因此Cl-及NH2CH2COO-沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面,然后再分成多个区带.大多数蛋白质在pH6.7或8.3时均带负电荷，在电场中，都向正极移动。(3)电位梯度的不连续性V(电泳速度)=E(电位梯度)*m(迁移率)E高m慢≈E低m快由于蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，因此也就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩形成一个狭小的中间层。2分子筛效应分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率-------分子筛效应。分子量小且为球形的蛋白质分子所受阻力小，移动快，走在前面;反之，则阻力大，移动慢，走在后面。分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，后者是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。3电荷效应进入pH8.9的分离胶中，各种蛋白质所带净电荷不同，而有不同的迁移率。表面电荷多，则迁移快；反之，则慢各种蛋白质按电荷多少、分子量及形状，以一定顺序排成一个个条型的区带，从而达到分离的目的。核酸（RNA）〈104104～105105～2×10615～205～102～2.6表1分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围适用的凝胶浓度（%）蛋白质〈1041～4×1041～5×104～1×1051×105〉5×10520～3015～2010～155～102～5凝胶浓度与被分离物分子量的关系：由于凝胶浓度不同，平均孔径不同，能通过可移动颗粒的分子量也不同.SDS电泳系统中引入了SDS和还原剂，如β-巯基乙醇和二硫苏糖醇（DTT）。SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，使蛋白去折叠变性，多聚体解聚为亚基。还原剂能断开链内和链间二硫键，使蛋白质以单链形式存在。解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成蛋白质-SDS复合物。其形状为长椭圆棒状，短轴的长度都一样，约为18Å，而长轴长度与蛋白质分子量成正比。在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质SDS的硫酸根带负电，使各种蛋白质的SDS复合物都带上相同密度的负电荷，大大超过蛋白质分子原有的电荷，因而屏蔽了不同种类蛋白质分子之间原有的电荷差异，从而使蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关，这样便能直接从电泳迁移率计算出蛋白质的分子量。在分子量15KD-200KD范围内，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系，即：lgMW=K-b·mRMW为蛋白质分子量K为截距b为斜率mR为相对迁移率在一定条件下，K和b均为常数根据上述方程将已知分子量的标准蛋白质电泳迁移率与分子量的对数作图，可制出一条标准曲线，测出同样条件下待测蛋白质的电泳迁移率，即可从标准曲线上查出其分子量本法测定分子量的误差约为10%。蛋白质完全变性二硫键全部还原与SDS充分结合样品处理二硫苏糖醇（DTT）0.3g(或β-巯基乙醇)1mL10%SDS4mL浓缩胶缓冲液1.6ml87%甘油2.5g0.05%溴酚蓝2mLddH2O至20mL1mL/管分装，－20℃保存。样品缓冲液（0.08MTris-Cl，pH6.8）×21.蛋白质的二硫键是否完全被还原。只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下，SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去，并使之具有相同的构象。所以样品处理时需加β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）。2.样品处理液中SDS单体的浓度:为了保证蛋白质与SDS的充分结合，溶液中SDS的总量至少要比蛋白质高3-4倍，甚至10倍以上。3.样品处理液的离子强度：应保持较低的离子强度（低于0.26），这样才能保证SDS有较高的单体浓度，与蛋白质充分结合。若样品的离子强度太高，需先透析或凝胶过滤除盐。4.样品中的蛋白质浓度需适当。浓度过高，易造成拖尾，甚至影响蛋白质迁移率与分子量对数的线性关系；浓度太低则不易检测。通常根据样品含有的蛋白质种类多少及所使用的检测方法确定蛋白质浓度，如用考马斯亮蓝染色，每种蛋白的浓度应为20～30μg/ml,若用银染，则只需0.3～0.5μg/ml。用样品缓冲液（0.08MTris-Cl，pH6.8）配制成每种标准蛋白质浓度均为0.5μg/ul的溶液，－20℃保存。使用前置室温融化后，沸水浴中加热3-5分钟后上样。配置贮备溶液A30%Acr/1%Bis贮液：Acr30gBis1.0g溶于去离子水，定容至100mL。棕色瓶4℃保存。B.分离胶缓冲液（1.5MTris-ClpH8.8）：TrisBase1.5MddH2O750mLHCl加至pH8.8ddH2O至1000mLC.浓缩胶缓冲液（1MTris-ClpH6.8）：TrisBase30.3gddH2O200mLHCl加至pH6.8ddH2O至250mLD.10%SDS：SDS10gddH2O至100mLE.10%AP：AP1gddH2O至10mLF.TEMEDG.10×SDS电极缓冲液(PH8.3)：Trisbase(FW121.1)250mMGlycine(FW75.1)2MSDS(FW288.4)1%(W/V)ddH2Oto100mLI.固定染色液：考马斯亮蓝R-2500.58g95%乙醇250mL冰醋酸50mLddH2O200mLK.脱色液：95%乙醇250mL冰醋酸80mLddH2O1000mL3.1安装垂直板电泳槽3.2分离胶制备12％,配10ml,加至距梳齿0.5cm，上覆盖1－2mm与水饱和的异丁醇。3.3浓缩胶制备5%，配4ml,插入加样梳，静置30分钟-1小时使其凝合。3.试验操作FinalGelConcentration5%7.5%10%12%15%30%Acr/1%Bis贮液(mL)1.612.423.224.04.841.5M分离胶缓冲液(mL)2.52.52.52.52.510%SDS(mL)0.10.10.10.10.1ddH2O5.744.934.133.32.5110%过硫酸胺0.10.10.10.10.1TEMED0.0040.0040.0040.0040.004TotalVolume(mL)1010101010(ml)(ml)FinalGelConcentration5%5％30%Acr/1%Bis贮液(mL)0.330.7浓缩胶缓冲液（1M,pH6.8）(mL)0.250.510%SDS(mL)0.020.04ddH2O(mL)1.42.710%过硫酸胺0.020.04TEMED0.0020.004TotalVolume(mL)24(ml)(ml)3.4上样与电泳将电泳槽与电泳仪连接好，上槽接负极，下槽接正极。上下槽中加满电极缓冲液，移液枪或微量注射器加样，每孔15ul。电泳条件：开始电压90V,待样品进入分离胶时，恒压130V，电泳约2.0h,直至前沿距下端约0.5cm。加样：标准蛋白（marker）：10ul,未知蛋白A：10ul未知蛋白B:10ul未知蛋白C：10ul注意：电泳样品加入样品处理液后，要在沸水浴中煮3～5min，使SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构。3.5凝胶板剥离与固定电泳结束后，关闭电泳仪。用不锈钢药铲撬开玻璃板，取出胶膜。4.7染色与脱色加入染色液，室温下染色1h，或60℃水浴染色10min。然后用脱色液脱色，更换脱色液3-4次，直至背景无色为止。考马斯亮兰R250检测灵敏度可达1ug.4.1电泳迁移率的计算4.2标准曲线的制作以各标准蛋白的相对迁移率为横坐标，分子量的对数为纵坐标绘制标准曲线。4.3待测蛋白质分子量的计算根据待测蛋白质的相对迁移率，可以直接从标准曲线上查出该蛋白质的分子量。4.实验结果处理思考题在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么?电极缓冲液中甘氨酸的作用?在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用?样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?