艾滋病实验室危害评估

艾滋病实验室危害评估贵州省艾滋病确认中心实验室刘勇一、危险程度分类（一）分类危险度分级传染病管理（二）实验室操作与生物安全防护实验室级别要求二、背景资料：（一）一般生物学特性1.病原学特性2.培养特性（二）艾滋病毒对外界环境的稳定性1.自然环境中的稳定性与对温度的敏感性2.化学因子的敏感性3.对紫外线等的敏感性二、背景资料（三）HIV的致病性（四）HIV的传播途径（五）艾滋病的预防、诊断和治疗1.预防2.诊断3.治疗三、拟从事实验活动的危险性分析及相应的预防措施四、工作人员的预防接种和工作人员素质五、评估结论（一）实验活动的防护措施（二）感染的控制和健康监护一、危害程度分类（一）分类危险度分级传染病管理根据2006年中华人民共和国卫生部制定的《人间传染的病原微生物名录》《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2004）WHO《实验室生物安全手册》（第三版.2004），Humanimmunodeficiencyvirus（HIV）typy1and2virus人类获得性免疫缺陷病毒（艾滋病毒I型和II型）属于危害程度第二类的病原微生物,其危险度Ⅲ级。根据2006年《中华人民共和国传染病防治法》，艾滋病属于乙类传染病。微生物危害程度分级等级危害Ⅰ（低个体危害，低群体危害）：不会导致健康工作者和动物致病、的)：能引起人或动物发病，但一般情况下对健康工作者、细菌真菌、病毒和寄生虫等生物因子危害等级Ⅱ(中等个体危害，有限群体危害群体、家畜或环境不会引起严重危害的病原体。实验室导致严重疾病，具备有效治疗和预防措施，并且传播风险感染有限微生物危害程度分级危害等级Ⅲ（高个体危害，低群体危害）：能引起人类或动物严重疾病，或成严造重经济损失，但通常不能因偶然接触而在个体间传播，或能使用抗生素、抗寄生虫药治疗的病原体危害等级Ⅳ(高个体危害，高群体危害)：能引起人类或动物非常严重的疾病，一般不能治愈，容易直接或间接或因偶然接触在人与人，或动物与人，或人与动物，或动物与动物间传播的病原体运输包装分类AUN2814（仅病毒培养物为A类）BUN3373（诊断标本、临床标本、生命物质）（二）实验室操作与生物安全防护实验室级别要求1.病毒培养BSL-32.动物感染实验ABSL-33.未经培养的感染材料的操作BSL-24.灭活材料及无感染性材料的操作BSL-1。二、背景资料（一）一般生物学特性1．病原学特性人免疫缺陷病毒分两型，即HIV-1和HIV-2。两者均能引起艾滋病，均为单链RNA病毒，分类上属于逆转录病毒科(Retroviridae)，慢病毒亚科(Lentivirus)。本病毒为圆形或椭圆形，直径约90—140nm，外层为类脂包膜，表面有锯齿样突起，内有圆柱状核心，由RNA逆转录酶、DNA多聚酶和结构蛋白等组成。病毒的包膜是糖蛋白gp120及gp41。gpl20为外膜蛋白，gp41为透膜蛋白(transmem—braneprotein)，起协助HIV进入宿主细胞的作用。结构蛋白包括p24核心蛋白和p18基质蛋白。HIV有9个基因，其中3个基因编码结构蛋白，即群抗原基因(groupspecificanti-gen，gag)编码核心蛋白p24，多聚酶基因(polymerase，pol)编码多聚酶，包膜蛋白基因(envelope，env)编码包膜蛋白gpl20和gp41。尚有3个调节基因，即反式激活因子(transactivator，tat)对HIV基因起正调控作用，病毒蛋白表达调节因子(regulatorofexpressionofvirionproteins，rev)能增加gag和env基因对结构蛋白的表达，和负因子(negativefactor，nef)具有抑制HIV增殖作用。另外还有四个基因即病毒感染因子(virioninfectivityfactor，vif)，其作用是在一些细胞因子协同下促进HIV在细胞内复制，R蛋白(viralprotein，R.vpr)，能使HIV在巨噬细胞中增殖；U蛋白(viralprotein，U.vpu)仅存在于HIV-1中，它能促进HIV-1从细胞膜上释放。HIV-2核苷酸序列中近40％一50％与HIV-1相同，在基因组中，不存在vpu基因而有X蛋白(viralprotein，X．vpx)，这是HIV-2在淋巴细胞和巨噬细胞增殖时所必需，且能促进病毒粒子的形成。HIV-2毒力较弱，临床上潜伏期较长，进展为AIDS所需时间亦较久。根据env基因V3段碱基排列的不同，HIV-1可分为9个亚型即A、B、C、D、E、F、G和O亚型。HIV既有嗜淋巴细胞性又有嗜神经性，主要感染CD4+T淋巴细胞，也能感染单核巨噬细胞、B细胞和小神经胶质细胞、骨髓干细胞等。HIV侵入人体后虽然能刺激机体产生抗体，但中和抗体很少，且作用极弱。在血清中同时有抗体和病毒存在的情况下，此血清仍有传染性。二、背景资料2.培养特性人的外周或骨髓中淋巴细胞经PHA刺激48～72小时作体外培养（培养液中加IL2）1～2周后，病毒增殖可释放至细胞外，并使细胞融合成多核巨细胞，最后细胞破溃死亡。亦可用传代淋巴细胞系如HT-H9、Molt-4细胞作分离及传代。二、背景资料HIV动物感染范围窄，仅黑猩猩和长劈猿，一般多用黑猩猩做实验。用感染HIV细胞或无细胞的HIV滤液感染黑猩猩，或将感染HIV黑猩猩血液输给正常黑猩猩都感染成功，但无论黑猩猩或长臂猿感染后都不发生疾病。二、背景资料（二）艾滋病毒对外界环境的稳定性1.自然环境中的稳定性与对温度的敏感性HIV对热敏感。56℃30分失去活性，但在室温保存7天，仍保持活性。不加稳定剂病毒-70℃冰冻失去活性，而35%山梨醇或50%胎牛血清中-70℃冰冻3个月仍保持活性。2.化学因子的敏感性对消毒剂和去污剂亦敏感，0.2%次氯酸钠0.1%漂白粉，70%乙醇，35%异丙醇、50%乙醚、0.3%H2O20.5%来苏尔处理5′能灭活病毒，1%NP-40和0.5%triton-X-100能灭活病毒而保留抗原性。3.对紫外线等的敏感性HIV0.1％甲醛溶液、紫外线和γ射线不敏二、背景资料（三）HIV的致病性HIV感染人体后直接和间接作用于CD4+T淋巴细胞，细胞功能受损和大量破坏，导致细胞免疫缺陷，免疫系统功能严重缺损因而促使并发各种严重的机会性感染和肿瘤的发生。发展到最后，导致艾滋病(获得性免疫缺陷综合征)常合并严重的机会感染，常见的有细胞（鸟分枝杆菌）、原虫（卡氏肺囊虫、弓形体）、真菌（白色念珠菌、新型隐球菌）、病毒（巨细胞病毒、单纯疱疹病毒，乙型肝炎病毒），Kaposis肉瘤或恶性淋巴瘤。最后死亡。二、背景资料（四）HIV的传播途径HIV感染者和AIDS病人是传染源传播途径有：1．性传播：通过男性同性恋之间及异性间的性接触感染。2．血液传播：通过输血、血液制品或静脉嗜毒者共用不经消毒的注射器和针头3．母婴传播：包括经胎盘、产道和哺乳方式传播。。二、背景资料（五）艾滋病的预防、诊断和治疗1.预防人类研究艾滋病疫苗已有20余年了，现国际上已进行了120多个艾滋病疫苗的临床测试，测试疫苗包括重组病毒载体疫苗、DNA疫苗、蛋白/多肽疫苗以及不同疫苗的组合。无论是艾滋病抗体疫苗还是细胞免疫疫苗均尚处于早期阶段，所研制的疫苗在理论上均难以克服艾滋病毒所带来的挑战。因为艾滋病毒I型至少包括9个亚型和众多的重组型。而且，病毒可不断通过遗传变异，逃逸免疫系统的识别与控制。至今还没有研制出有效预防艾滋病的疫苗。二、背景资料2.诊断1）抗体检测筛查：主要有酶联免疫吸附试验（ELISA）确证：抗体筛查阳性者可做Westernblot（WB，蛋白印迹法）进一步确证。2)抗原检测用ELISA检测P24抗原,在HIV感染早期尚未出现抗体时,血中就有该抗原存在.由于P24量太少,阳性率通常较低。现有用解离免疫复合物法或浓缩P24抗原，来提高敏感性。二、背景资料3）核酸检测用PCR法检测HIV基因，具有快速、高效、敏感和特异等优点，目前该法已被应用于HIV感染早期诊断及艾滋病的研究中。4）病毒分离常用方法为共培养法，即用正常人外周血液分离单个核细胞，加PHA刺激并培养后，加入病人单个核细胞诊断及艾滋病的研究。二、背景资料3.治疗已有的抗病毒药物和治疗方法，虽不能治愈艾滋病，但实施规范的抗病毒治疗可有效抑制病毒复制，降低传播危险，延缓发病，延长生命，提高生活质量。三、拟从事实验活动的危险性分析及相应的预防措施实验室检测：要求在生物安全二级防护实验室进行血清学检测，操作者应着防护装备，戴手套。实验室的污染废弃物均须无害化处理后方能移出实验室并交特种垃圾场处置。发生感染性材料的溢出/洒漏，必须使用吸水材料覆盖，使用0.5%的次氯酸钠或其他有效的消毒剂由外向中心喷洒，作用30min后移出。四、工作人员的预防接种和工作人员素质根据《中华人民共和国传染病防治法》《全国艾滋病检测工作管理办法》《全国艾滋病检测技术规范》WHO《实验室生物安全手册》等制定艾滋病检测实验室人员健康管理规定。1.经过规范的生物安全和艾滋病检测技术培训，并经过严格考核合格者方能进入其相关实验操作区2.实验室人员必须在身体状况良好的情况下，才能进入实验室工作，皮肤破损者应有严格的保护措施或暂时停止工作。3.建立健康监护档案，每年进行HIV抗体检测。由于人源物质存在其他潜在的感染因子，应尽可能提供有效的预防接种，如乙型肝炎疫苗的接种等。4.贵州省CDC艾滋病确证中心实验室共有技术人员8名,其中申请进入BSL-2的人员8名,所有技术人员均参加过生物安全培训,经检测HIV抗体阴性,健康状态良好.五、评估结论（一）实验活动的防护措施凡是涉及HIV检测的操作,均可能发生通过破损的皮肤和黏膜接触、锐器刺伤等实验室意外感染，因此涉及HIV阳性样本的操作应在A2型生物安全柜中进行。上岗前必须接受严格的生物安全及艾滋病检测技术培训，按照BSL-2实验室级别进行个人防护。实验完毕后能高压的废弃物在实验室内121℃高压处理20min后才允许运出实验室，不能高压的物品用0.5%有效氯的次氯酸钠浸泡30min以上。五、评估结论（二）感染的控制和健康监护从事HIV研究的实验室工作人员必须在身体状况良好的情况下，才能进入BSL-2实验室工作，出现下列情况不能进入：孕妇和免疫力低下者，手部、颜面部皮肤破损且不易防护者，已经在BSL-2实验室控制区域内连续工作8小时或由于其他原因造成的处于疲劳状态者都不宜从事HIV的检测操作。五、评估结论（二）感染的控制和健康监护从事HIV研究的实验室工作人员在进入实验室操作之初，必须先检测HIV抗体，以后每年定期复检。一旦发生实验室操作暴露（职业暴露），应报告实验室负责人和单位负责人，立即进行暴露级别评估，必要时使用基本用药程序/强化用药程序进行药物阻断，并进行3～6个月的医学随访，给出医学结论，职业暴露感染者报卫生行政主管部门处理。参考文献《中华人民共和国传染病防治法》《人间传染的病原微生物名录》《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2004）WHO《实验室生物安全手册》《全国艾滋病检测工作管理办法》《全国艾滋病检测技术规范》