具有质控功能的新型精子分析仪的创新设计

具有质控功能的新型精子分析仪的创新设计徐元诚[1]周作民[2]孔令柱[3]徐建平[4]陆金春[5]崔毓桂[6][摘要]《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》第5版确立了标准化的精液分析方法，得到全球男科学和生殖医学界的认可。该版手册最显著的特点体现在两个方面：（1）规范精液分析的质量保证和质量控制；（2）对精子形态学分析进行了标准量化。该手册肯定了精子分析仪（CASA）较人工方法的优势。目前中国普遍使用的CASA，缺少质量保证，也不能对精子形态进行准确测量分析，这就很难达到WHO精液分析第5版的要求，难以适应当前国际男科学的发展，甚至影响将来在国际上发表高水平的SCI论文。基于WHO精液分析第5版的两个特点，我们创新设计了新型CASA，解决了精子分析的准确形态学测量和质量控制，采用精子活力3类4级的分类系统、统计学处理和视频记录等功能可以保证检测数据的可靠性。新型CASA与国际接轨，推动中国实验室实施精液分析的标准化，有助于开展多中心大样本的研究。[关键词]精子分析仪；精子形态；精子活力；质量控制；质量保证引言20世纪80年代，计算机辅助精子分析仪（CASA）在欧美等发达国家开始用于临床研究，现在已广泛用于全世界很多男科实验室[1，2]。根据“严格”标准分类系统编写的精子形态学分析软件也于90年代中期在国外率先应用于临床[3，4]。上世纪90年代初，中国研发了第一台CASA，至今已有20年。目前，国内50%的医院采用CASA进行精液常规分析[5]。CASA的普遍使用，提高了精液检测结果的准确性，也促进了中国男科学和生殖医学的发展。用CASA分析精子活力、浓度和形态学，较人工方法具有两个优势：（1）高精确性；（2）提供精子动力学参数的量化数据（前向运动精子和超活化运动，及获能精子特征参数）[6]。CASA分析视频记录的功能更容易实现标准化和更好地实施质量保证程序[6]。影像分析具有使精子形态学评估量化、客观性和可重复性获得重要进展的潜力[6]。中国的实际情况是：大多数已经使用CASA的实验室，虽然对CASA的性能争议较大[1]，但放弃CASA改用人工方法的可能性不大。2011年3月，《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》第5版中文版（简称手册第5版）由人民卫生出版社出版发行，这在我国男科学界引起了广泛关注。手册第5版强调：（1）精液检查的标本需要重复抽样，非实验因素应该均衡一致；（2）每次分析的精子总数应该大于400条，检测数据必须经过95%可信区间检验并以均值出报告；（3）精子运动轨迹要有视频录像记录并通过重复播放进行人工验证。国内学者一致认为：WHO手册第5版对精液检查的质量保证和质量控制提出了较高的要求，使得结果更能反映精子质量的实际情况，这些要求必须在实际操作中予以贯彻，但同时也提出了一些异议，主要体现在：（1）精子的前向运动速度是预测生育力的重要指标，手册第5版忽略了快速前向运动精子的百分率，这对男性生育力的准确判断具有很大影响。（2）实验步骤繁琐，花费的时间和精力较多，因此可操作性较差。（3）用人工的方法对运动精子数量和速度的判断难度较大，不同的操作者对同一份标本进行检测可能会得出截然不同的结果。（4）实验室普遍缺乏精子形态学评估的工具，无法准确测量精子的形态参数；而人工观察精子形态难以正确掌握严格评估精子形态的标准。因此，采取怎样的方法使第第5版提出的精液检测国际要求得到有效的落实是我们迫切需要解决的问题。特别是如何开发能够满足第5版精液检测要求的CASA显得非常重要。质量保证（QA）和质量控制（QC）是任何实验室检测分析过程中必不可少的环节[7]。质量保证措施是评价实验室分析结果准确度和精确度的关键。目前中国普遍使用的CASA，缺少质量保证，也不能对精子形态进行准确测量分析，这就很难达到WHO精液分析第5版的要求，难以适应当前国际男科学的发展，甚至影响将来在国际上发表高水平的SCI论文。笔者认为：CASA应该增加以下功能：（1）能够精确测量精子运动参数和形态参数的测量功能；（2）自带视频记录和重复播放的质控功能，具有对检测数据95%可信区间自动检验并以均值出报告的统计学处理功能。具有测量与质控功能的CASA，有助于落实手册第5版推荐的检查精液的标准程序，从而维持高标准的仪器操作。国产CASA的应用现状在手册第5版，大量篇幅详尽描述了精液分析的标准化方法、统计学处理措施，目的就是使检测结果具有准确性、可靠性、可重复性，能在全球范围内比较。手册第5版（中文版）正式出版后，国家人口与计划生育科研所、《中华男科学杂志》编辑部等单位组织了多次学习班，由专家解读手册第5版的内容，对各级技术人员进行了质量控制的系统培训。国产CASA的普遍使用，适应了病人很多而技术人员相对太少的实际情况。但是，国产CASA存在质量参差不齐、功能较进口CASA落后等诸多问题，主要体现在：（1）无法精确判定精子，导致误判率高；（2）缺乏视频记录回放功能，无法回顾性地判断结果的可靠性；（3）缺乏质量控制程序，且不同型号的CASA精确程度不一致，导致缺乏可比性。对以上问题若不进行改进和创新，势必影响中国实验室与国际接轨，严重影响与精液分析相关的科学研究的可信度和被认可度，研究结果也难以与国际学术界进行有价值的比较和交流。手册第5版的编者Baker这样评论：在中国，CASA的使用率很高，但无质量保证，不同的CASA没有外部质量控制验证，因此存在测试结果的差异[8]。面对某些论文中一系列CASA的数据，经常会质疑其可靠性：该实验室是否坚持了重复取样的质控原则？检测结果是否进行了可信区间的统计学处理？实验操作程序有没有完整的原始记录方便查证？如何使国产CASA具有质量保证和质量控制，这是提高我国精液分析水平和质量的关键。我国各级医院的血液学、生化检验的质量控制已经越来越规范。但是，很少有实验室对精液分析进行室内和室间质量控制[5]。精液分析的质量保证和质量控制在中国难以推广有很多原因：（1）精子在精液中的非正态分布使质控措施变得非常复杂；（2）精液检查过程中影响检测结果的非实验因素很多；（3）人工观察对精子运动的速度以及是否呈直线运动的评估，实际操作很困难；（4）对于精子浓度大于50×106/ml的精液标本，因精子间的碰撞明显增加而影响CASA检测结果的准确性；（5）对精子形态学分析的严格标准难以达成共识；（6）实验室技术人员不完全了解获得精确检测值的统计学原理等。这一系列问题严重影响手册第5版在中国的推行，特别是切实执行精液检查标准化程序，直接影响中国实验室精液检查的结果和科学研究水平。受国内普遍采用的国产CASA限制，中国学术界对“要不要立即执行手册第5版推荐的标准和方法”进行了多次大辩论，对涉及的上述问题难以达成一致。在新型CASA面世之前，这些争辩是可以理解的。最迫切的是，研发自带质控功能和精子形态测量功能的新型CASA。具有测量与质控功能的新型精子分析仪的研发两年来，笔者的研发团队在学习进口CASA软件设计的基础上，紧紧围绕新推出的WHO手册第5版，创新设计、持续研究，开发出的新型CASA具备了精子形态测量功能和质量控制功能，具有我国完全的知识产权。研发工作不断取得重大突破，主要有:（1）新型CASA增加了精确的统计学处理功能；（2）全面符合手册第5版要求的检测报告；（3）能够连续记录精子运动轨迹；（4）能够测量并显示任何一条精子的所有运动参数并显示连续性轨迹图；（5）能够测量单个精子头部和颈部的多个形态参数并能长期保存所有分析图像。在软硬件方面，我们设计推出的新型CASA，较目前国产CASA，有如下创新：1.使用相差显微镜国产CASA大多采用普通生物显微镜，而手册第5版推荐的是相差显微镜。因此，在新型CASA系统，我们采用相差显微镜，使精子和大多数杂质清晰地区分，提高了精子捕捉率，错捕率显著下降。使用质控珠和质控精液样本，新型CASA可对任意视野的图像进行人工验证，再对照检测结果，可以确定质控珠或精子的漏捕率和错捕率，从而评估CASA对精子浓度的检测质量。2.增加视频记录功能和任意精子的运动参数测量功能数码摄像机（CCD）技术近年来发展迅速，尤其是自带软件的高帧数、高分辨率的CCD是完整记录精子运动连续性轨迹的关键。我们设计的新型CASA系统，使用的CCD能够确保每秒50帧以上的图像记录和回放速度。该技术可以重播录存的各种泳动速度的活动精子影像，同一视频片段反复播放，并可以任意截图形成照片。用鼠标点击任意一条精子，将全屏显示其运动轨迹和9个运动参数。新型CASA所应用的这种数字化图像处理技术，优于手册第5版的人工视频录像方法。此外，新型CASA的视频记录功能使精子活力分析有了自带的内部质量控制，既能验证CASA对精子活力分析的正确性，还能任意拷贝影像资料方便会诊或学术交流。3.创新设计精子活力3类4级的分类系统手册第5版推荐的精子运动3级分类方法，具有基于人工方法的实际可操作性，因为人工区分a、b级精子是困难的。手册第4版[9]提出的4级分类系统已经得到大量临床观察结果的支持：只有那些具有特殊运动形式的精子才能穿透宫颈黏液[10]。CASA也证实，快速运动精子的浓度和妊娠率呈正相关[11]。手册第5版对前向运动（PR）的定义是：精子主动地呈直线或沿一大圆周运动，不管其速度如何。肉眼在显微镜下只能评估精子的曲线运动速度（VCL），几乎所有CASA都能够测量人工难以观察的精子直线运动速度（VSL）。我们认为，VSL比VCL更能体现精子是否“呈直线运动”。手册第5版提及的CASA术语中还有2个判断精子是否主动地呈直线运动的辅助指标：（1）VSL与VCL的比值，即直线性（LIN），LIN=VSL/VCL,LIN值越大精子直线运动状况越好；(2)VSL与VAP(平均运动速率)的比值，即前向性（STR），STR=VSL/VAP,STR值越大精子直线运动状况越好。由于国内普遍使用了CASA，而且在不孕不育症的诊疗流程中，普遍强调快速前向运动精子总数的重要性。所以，必须完善精子运动的分类系统，弥补手册第5版推荐的精子活力等级评估系统的不足。结合手册第4版对精子运动速度的规定和手册第5版对精子运动分类的定义，我们设计的新型CASA把精子活力分成3类4级。具体方法是：（1）把VSL=0的精子定义为不动精子（IM）；（2）把VSL＜5μm/s，或VSL在5-25μm/s之间，但直线性(LIN)或前向性(STR)差的精子（LIN≤0.5或STR≤0.8），定义为非前向运动精子（NP）；（3）把VSL＞25μm/s，或VSL在5-25μm/s之间，但直线性和前向性好的精子（LIN＞0.5且STR＞0.8），定义为前向运动精子（PR）；（4）把PR中直线运动速度较快的的一部分精子，即VSL＞35μm/s的精子，定义为快速前向运动精子，额外统计出来供临床医生参考。这样的3类4级设计思路，不仅完善了手册第5版判断精子是否呈直线运动的条件，而且保留了手册第4版精子活力分类中a级精子具有临床实用价值的优点，有助于平衡中国学术界对手册第5版不统计a级精子的意见分歧。上述精子运动3类4级的分类系统在软件编程上并无困难，而要把单个精子的运动轨迹图与相关参数结合视频片段的重复播放进行分类合理性和正确性的验证，就对软件编程提出了很高的要求。新型CASA很好地解决了这些问题。当然，运动参数临界值的设定是人为的，可以通过多中心大样本的研究工作结果进行修正。4.增加统计学处理功能手册第5版认为：CASA分析仪应当链接能进行数据整合和统计学分析的计算机软件。新型CASA增加的统计学处理功能，包括：（1）符合手册第5版规定的全部统计学处理方法；（2）能自动对精子浓度、活力、形态的两次抽样标本的检测数据进行95%可信区间检验并以均值出报告；（3）对通不过可信区间检验的数据则提醒重新抽样，并拒绝用均值出报告；（4）对检测精子总数不足400条的样本分析会自动计算抽样误差并在报告上注明。为此，我们进行了一系列的对比研究项目，以西班牙产精子分析仪（SCA）和新型CASA做对比，全部