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1实验二限制性核酸内切酶消化质粒DNA2一、实验目的1.掌握限制性核酸内切酶消化质粒DNA的原理与方法。2.了解酶切反应条件。3二、实验原理限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中某特定核苷酸序列，并在识别位点内或附近切割双链DNA的核酸内切酶。在一定条件下（如合适温度、盐浓度等），它能在特定的切割位点裂解DNA分子中的磷酸二酯键而将双链DNA分子断开。4Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5‘-CCC↓GGG-3’)；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端（3’突出和5’突出的单链末端）的DNA片段称粘性末端，如EcoRⅠ、HindⅢ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。二、实验原理5EcoRⅠ5ˊ-G↓AATTC-3ˊ5ˊ-GAATTC-3ˊ3ˊ-CTTAA↑G-5ˊ3ˊ-CTTAAG-5ˊ+HindⅢ5ˊ-A↓AGCTT-3ˊ5ˊ-AAGCTT-3ˊ3ˊ-TTCGA↑A-5ˊ3ˊ-TTCGAA-5ˊ+6质粒是细菌细胞内独立于染色体之外能自主复制的双链环状DNA分子。本实验用到的是pGEM-TEasy质粒。二、实验原理7凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。质粒有3种构型：1、超螺旋的共价闭合环状质粒DNA；2、开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂；3、线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同,因此电泳后呈3条带。超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA和开环质粒DNA。二、实验原理8EcoRⅠ或HindⅢ可以将pGEM-TEasy质粒DNA切开成为线性DNA。用未经酶切的pUC质粒DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以推测酶切是否成功。_+二、实验原理Marker12图片说明：1未经酶切的质粒DNA2经EcoRⅠ或HindⅢ酶切后的线性DNA和目的DNA3000bp2000bp1000bp600bp500bp目的DNA9三、仪器与试剂主要仪器：恒温水浴箱、离心机、电泳槽与电泳仪主要试剂：限制性核酸内切酶（EcoRⅠ、HindⅢ）10×酶切缓冲液琼脂糖上样缓冲液0.5×TBE缓冲液质粒DNA10四、实验步骤1.建立反应体系：0.5mL无菌的EP管(总体积20μL)2.37℃，水浴1h。3.低速短暂离心。4.加4μL上样缓冲液于离心管中混匀，1%琼脂糖凝胶电泳（100V,40min）。(取12μL点样)无菌双蒸水12μL质粒2μL10×buffer酶切缓冲液2μL内切酶EcoRⅠ4μL轻轻混匀，低速短暂离心11质粒酶切电泳图五、实验结果12六、注意事项1、操作时注意：（1）分子生物学实验多为微量操作，注意吸样量的准确性。（2）要求在冰上操作，并充分混匀。（3）打开EP管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。（4）水浴时，将EP管盖严，以防水进入管内。13六、注意事项2.内切酶的使用时注意：(1)不使其污染与浪费；(2)注意加样顺序；(3)注意限制性内切酶体积不应大于反应总体积的1/10，避免星活性（产生星活性的原因：高甘油含量、酶量过大、低离子强度、高pH（8.0）、含有有机溶剂、非Mg2+的二价离子存在）。14六、注意事项3.质粒DNA对结果的影响：作为内切酶底物，DNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。这种抑制作用可通过下列方式克服：（1）增加酶作用单位数（10-20U/ugDNA）、（2）增大反应体积以稀释可能的抑制剂（3）延长反应时间154、反应缓冲液的影响反应缓冲液主要由Tris·HCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+为内切酶辅基；Tris·HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间；NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度：低盐（10mMNaCl)中盐（50mMNaCl）高盐（100mMNaCl）不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。六、注意事项165、酶切消化反应的温度：DNA消化反应的温度，是影响限制内切酶活性的一个重要因素。不同的核酸内切限制酶，具有各自的最适反应温度。多数限制内切酶的最适反应温度是37℃，少数限制性内切酶的最适反应温度高于或低于37℃。六、注意事项176、酶切消化反应的时间：反应时间根据酶的单位与DNA用量之比来定，原则是DNA:酶=２-３:１。本实验1小时即可充分酶解。六、注意事项187、限制性内切酶反应的终止，通常有以下两种方法：（1）采用65℃条件下温浴20min，通过加热失活内切酶；（2）加终止反应液（如0.5mol/L的EDTA使之在溶液中的终浓度达到10mmol/L）螯合内切酶的辅助因子Mg2+使内切酶变性以终止反应.六、注意事项19谢谢各位